1. Молочный жир

Молочный жир (от греч. lipos – жир) – традиционное обозначение в молоке липидов.

Липиды – природные органические соединения, которые объединены в одну группу по характеру растворимости.

Количество молочного жира в коровьем молоке колеблется от 3 до 5%. Он является важнейшей составной частью молока, ценообразующим, как и белок, при реализации молочного сырья.

Однако с биологической точки зрения и физиологии питания белки превосходят молочный жир.

Молочный жир – источник энергии, энергетическая ценность 1 г его равна 37,681 кДж (9 ккал). Благодаря содержанию жира молочные продукты имеют выраженные вкус, аромат, структуру и консистенцию. Он предотвращает такие пороки молочных продуктов, как крупитчатость и водянистость.

Биологическая ценность молочного жира определяется, в первую очередь, наличием в нём полиненасыщенных жирных кислот семейств омега-6 и омега-3. Присутствие в молочном жире значительных количеств фосфолипидов и витаминов (А, D, Е) повышает его биологическую ценность.

ГОСТ Р 52054 предусматривает следующие методы испытаний при контроле массовой доли жира в молоке и молочных продуктах: гравиметрический (ГОСТ 22760), кислотный и оптический (ГОСТ 5867) и инструментальный (ГОСТ 32255).

1.1. Гравиметрический метод определения массовой доли жира (ГОСТ 22760)

Настоящий стандарт распространяется на молоко (цельное, обезжиренное сырое, пастеризованное, гомогенизированное), сливки и молочные продукты без сахарозы (кисломолочные напитки, творог, сухое молоко) и устанавливает гравиметрический метод определения жира по Розе-Готлибу. Метод используют для проведения государственных испытаний приборов, а также при разработке ускоренных методов определения жира и в спорных случаях.

Сущность метода заключается в экстрагировании жира из аммиачно-спиртового раствора молока диэтиловым и петролейным эфирами, выпариванием растворителей и взвешиванием остатка.

Оборудование, материалы, реактивы. Весы лабораторные с наибольшим пределом взвешивания 200 г ценой поверочного деления 0,001 г; шкаф сушильный с вентиляцией и автоматической регулировкой температуры типа СЭШ-3 или шкаф вакуумный сушильный типа ВШ-0,035А; экстрактор с фторопластовыми притертыми пробками (рис. 1); сосуды; колбы для экстрагирования с притертыми пробками; колбы тонкостенные вместимостью от 150 до 250 мл; эксикатор, крышка эксикатора пришлифована к плоскости верхнего края его корпуса и для достижения герметичности смазывается специальной вакуумной смазкой или вазелином; аппарат для перегонки: холодильник стеклянный лабораторный, колба для перегонки вместимостью 250 мл; баня водяная с обогревом; термометры ртутные стеклянные с диапазоном измерения от 0 до 100°С, с ценой деления шкалы 1°С и с диапазоном измерения от 100 до 200°С, с ценой деления 1°С; материал, облегчающий кипение, обезжиренный, непористый, не ломкий при употреблении: стеклянные шарики или кусочки карборунда; кальций хлористый технический кальцинированный прокаленный; калий йодистый, водный раствор с массовой долей йодистого калия 10 %; аммиак, водный раствор с массовой долей аммиака 25 %; спирт этиловый ректификованный высшей очистки; центрифуга для определения массовой доли жира в молоке и молочных продуктах; растворители: эфир диэтиловый, без перекисей; эфир петролейный, растворитель смешанный, приготовленный непосредственно перед использованием при введении равных объемов диэтилового и петролейного эфиров, вода дистиллированная.

Рис. 1. Экстрактор: 1 – трубка из нержавеющей стали диаметром 3 мм; 2 – фторопласт

Все реактивы должны быть чистыми для анализа и не должны оставлять осадка больше, чем при контрольном опыте. Если масса осадка при контрольном опыте превышает 0,0005 г, реактивы подвергают очистке перегонкой с 1 г молочного жира на 1 мл растворителя.

Для проверки наличия перекисей в диэтиловом эфире в колбу с притертой пробкой (предварительно ополоснутую диэтиловым эфиром) вносят 1 мл свежеприготовленного 10 %-ного йодистого калия и 10 мл диэтилового эфира. Все это встряхивают и выдерживают в течение 1 мин. Слой эфира при этом не должен желтеть.

Подготовка к анализу. Пробу молока, сливок или кисломолочных напитков доводят до 20±2°С, тщательно перемешивают до однородной консистенции, чтобы диспергировать жир. При этом пробу сильно не встряхивают, чтобы не вызвать их вспенивания или сбивания молочного жира. В случае трудности диспергирования жира в молоке, сливках и кисломолочных напитках пробу при осторожном перемешивании медленно нагревают до 40±2°С, тщательно перемешивают и быстро охлаждают до 20±2°С.

Техника определения

Колбу для перегонки вместе с материалом, облегчающим кипение (стеклянные шарики или кусочки карборунда), высушивают в сушильном шкафу при 102±2°С или в вакуум-сушильном шкафу при 70–75°С и давлении 6,66 Па в течение 0,5–1 ч., охлаждают в эксикаторе до 20±2°С и взвешивают.

Первое экстрагирование. Масса навески продукта с массовой долей жира до 5% – от 10 до 11 г. Массу навески продукта с массовой долей жира более 5% (m_p) в граммах вычисляют по формуле

где Ж₁ – массовая доля жира, установленная по ГОСТ 5867,%.

Навеску молока, сливок, кисломолочных напитков помещают в экстрактор, сосуд (колбу) для экстрагирования. Навеску творога помещают в экстрактор, сосуд (колбу) для экстрагирования и добавляют от 6 до 8 мл дистиллированной воды. Навеску сухого молока помещают в экстрактор, сосуд (колбу) для экстрагирования и добавляют от 9 до 19 мл дистиллированной воды. Затем экстрактор, сосуд или колбу для экстрагирования с навеской творога или сухого молока помещают в водяную баню с температурой воды 38±2°С и перемешивают до получения однородного раствора.

В экстрактор или колбу (сосуд) для экстрагирования с продуктом вводят 1,5 мл 25 %-ного раствора аммиака и тщательно перемешивают, приливают 10 см³ этилового спирта и аккуратно смешивают, не закрывая.

Добавляют 25 мл диэтилового эфира, закрывают экстрактор, сосуд (колбу) и интенсивно встряхивают, переворачивая его в течение 1 мин. При необходимости охлаждают сосуд в проточной воде. Осторожно вынимают пробку и добавляют 25 мл петролейного эфира, предварительно сполоснув пробку и горлышко экстрактора, сосуда (колбы) так, чтобы растворитель попал внутрь. Закрывают экстрактор, сосуд (колбу), встряхивают, переворачивая его в течение 30 с, и центрифугируют в течение 15±1 мин. или оставляют в покое до тех пор, пока верхний слой жидкости не станет прозрачным и четко не отделится от водного слоя.

Вынимают пробку, ополаскивают ее и горлышко экстрактора, сосуда (колбы) смешанным растворителем, сливая его внутрь экстрактора, сосуда, и аккуратно переливают по возможности большую часть эфирного слоя декантацией в колбу для перегонки. Для облегчения декантации в экстрактор, сосуд (колбу) для экстрагирования можно добавить дистиллированную воду с целью поднятия поверхности раздела между двумя слоями. Ополаскивают внутреннюю и внешнюю части горлышка экстрактора, сосуда (колбы) для экстрагирования смешанным растворителем, сливая его в колбу для перегонки.

Добавляют 5 мл этилового спирта в экстрактор или сосуд (колбу) для экстракции, ополаскивая внутреннюю поверхность и перемешивая содержимое.

Второе и третье экстрагирование проводят по методике первого экстрагирования, используя 15 мл диэтилового и 15 мл петролейного эфиров.

При анализе обезжиренного молока третье экстрагирование не проводят.

1.2. Определение массы экстрагированного жира

Из колбы для перегонки тщательно удаляют выпариванием и перегонкой как можно больше растворителей и этилового спирта. После исчезновения запаха растворителей нагревают колбу в горизонтальном положении в сушильном шкафу при 102±2°С или в вакуумном шкафу при 70–75°С и давлении 6,66 Па в течение 1 ч. Колбу помещают в эксикатор для охлаждения до 20±2°С и взвешивают.

Последующие взвешивания колбы производят после высушивания при тех же режимах в течение 30–60 мин. до тех пор, пока разница в массе между последовательными взвешиваниями не будет более 0,0003 г.

Если при одном из взвешиваний после высушивания будет увеличение массы, для расчетов принимают результаты предыдущего взвешивания.

Разность между массами колб с жиром и без жира, доведенными до постоянной массы, представляет массу экстрагированного жира.

Для установления, что все экстрагированное вещество является жиром, в колбу для перегонки добавляют 15–25 мл петролейного эфира, осторожно нагревают и взбалтывают до полного растворения экстрагированного вещества.

При неполном растворении экстрагированного вещества из колбы для перегонки полностью экстрагируют жир путем нескольких промывок петролейным эфиром и три раза ополаскивают внешнюю сторону горлышка колбы растворителем.

После исчезновения запаха растворителей нагревают колбу в горизонтальном положении в сушильном шкафу при 102±2°С или в вакуумном шкафу при 70−75°С и давлении 6,66 Па в течение 1 ч. Колбу помещают в эксикатор для охлаждения до 20±2°С и взвешивают.

Разность между массами колб с жиром и окончательной массой после экстрагирования жира петролейным эфиром, доведенными до постоянной массы, представляет массу экстрагированного жира.

Одновременно с определением жира в молоке, сливках или молочных продуктах без сахарозы проводят контрольный опыт с 10 мл дистиллированной воды, используя те же реактивы. Массовую долю жира в пробе Ж₂,%, вычисляют по формуле

где m – масса навески, г;

m_{1 –} масса колбы с жиром, высушенная до постоянной массы, г; m₂ – масса колбы без жира, высушенная до постоянной массы, г; m₃ – масса колбы в контрольном опыте после анализа, г;

m_{4 –} масса колбы в контрольном опыте до анализа, г.

За окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое результатов двух параллельных определений.

1.3. Кислотный метод определения массовой доли жира (ГОСТ 5867)

Метод основан на выделении жира из молока, молочного напитка, молочных и молокосодержащих продуктов, кисломолочных продуктов, сыра и сырных продуктов, масла и масляной пасты, сливочно-растительного спреда и сливочно-растительной топленой смеси, мороженого под действием концентрированной серной кислоты и изоамилового спирта с последующим центрифугированием и измерении объема выделившегося жира в градуированной части жиромера. (Действует только на территории Российской Федерации).

Оборудование, материалы, реактивы. Жиромеры стеклянные; пробки резиновые для жиромеров; пипетки объемом 5, 6, 10 и 10,77 мл; груша резиновая; приборы (дозаторы) для отмеривания изоамилового спирта и серной кислоты вместимостью, соответственно, 1 и 10 мл; центрифуга для измерения массовой доли жира молока и молочных продуктов с частотой вращения не менее 1000 мин^-1 и не более 1100 мин^-1; бани водяные, обеспечивающие поддержание температуры 65±2 и 73±3°С; штатив для жиромеров; термометры ртутные стеклянные с диапазоном измерения от 0 до 100°С; весы лабораторные с наибольшим пределом взвешивания 200 г; цилиндры объемом 50, 100 мл; ареометр общего назначения с диапазоном измерения от 700 до 2000 кг/м³; часы песочные на 5 мин. или секундомер; кислота серная; спирт изоамиловый; вода дистиллированная.

Техника определения

1. Молоко (сырое, пастеризованное различных видов), сливки. В два молочных жиромера (типов 1-6 или 1-7), стараясь не смочить горло, наливают дозатором по 10 мл серной кислоты (плотностью от 1810 до 1820 кг/м³) и осторожно, чтобы жидкости не смешивались, добавляют пипеткой по 10,77 мл молока, приложив кончик пипетки к горлу жиромера под углом. Уровень молока в пипетке устанавливают по нижней точке мениска. Молоко из пипетки должно вытекать медленно. После опорожнения пипетку отнимают от горловины жиромера не ранее чем через 3 с. Выдувание молока из пипетки не допускается.

Дозатором добавляют в жиромеры по 1 мл изоамилового спирта. Уровень смеси в жиромере устанавливают на 1–2 мм ниже основания горловины жиромера, для чего разрешается добавлять несколько капель дистиллированной воды. Рекомендуется для повышения точности измерений, особенно для молока низкой плотности, применять взвешивание при дозировке пробы. В этом случае сначала взвешивают 11,0 г молока с отсчетом до 0,005 г, затем приливают серную кислоту и изоамиловый спирт. Жиромеры закрывают сухими пробками, вводя их немного более чем наполовину в горловину жиромеров. Жиромеры встряхивают до полного растворения белковых веществ, переворачивая не менее 5 раз так, чтобы жидкости в них полностью перемешались.

Рекомендуется для обеспечения проведения измерений наносить мел на поверхность пробок для укупорки жиромеров. Устанавливают жиромеры пробкой вниз на 5 мин. в водяную баню при температуре 65±2°С. Вынув из бани, жиромеры вставляют в стаканы центрифуги градуированной частью к центру. Жиромеры располагают симметрично, один против другого. При нечетном числе жиромеров в центрифугу помещают жиромер, наполненный водой вместо молока, серной кислотой и изоамиловым спиртом в том же соотношении, что и для анализа. Жиромеры центрифугируют 5 мин. Каждый жиромер вынимают из центрифуги и движением резиновой пробки регулируют столбик жира так, чтобы он находился в градуированной части жиромера.

Жиромеры погружают пробками вниз на 5 мин. в водяную баню при температуре 65±2°С, при этом уровень воды в бане должен быть несколько выше уровня жира в жиромере. Жиромеры вынимают по одному из водяной бани и быстро производят отсчет жира. При отсчете жиромер держат вертикально, граница жира должна находиться на уровне глаз. Движением пробки устанавливают нижнюю границу столбика жира на нулевом или целом делении шкалы жиромера. От него отсчитывают число делений до нижней точки мениска столбика жира с точностью до наименьшего деления шкалы жиромера. Граница раздела жира и кислоты должна быть резкой, а столбик жира прозрачным. При наличии «кольца» (пробки) буроватого или темножелтого цвета, различных примесей в столбике жира или размытой нижней границы измерение проводят повторно.

Определение жира проводят в соответствии с требованиями, указанными в таблице 1, и следующими дополнительными условиями: последовательность операций при заполнении жиромера:

• отвешивание продукта в жиромер с отсчетом до 0,005 г,
• добавление воды (при необходимости),
• добавление серной кислоты и изоамилового спирта.

Таблица 1. Требования при оценке массовой доли жира в молоке

Наименование продукта	Тип жиромера	Объем, масса образца для анализа	Объем добавленной воды, см3	Плотность серной кислоты, кг/м3	Объем серной кислоты, см3	Количество центрифугирований
Молоко всех видов, кроме обезжиренного	1-6; 1-7	10,77 мл 11,00 г	−	От 1810 до 1820	10	1
Сливки негомогенизированные с массовой долей жира не более 40%	1-40	5,00 г	5	От 1810 до 1820	10	1
Сливки негомогенизированные с массовой долей жира более 40 %	1-40	2,50 г	7,5	От 1810 до 1820	10	1
Молоко нежирное и пахта	2-0,5 2-1,0	10,77 мл х 2	−	От 1810 до 1820	20	3

Серную кислоту в жиромер с водой добавляют осторожно, слегка наклонив жиромер; при определении жира в сливках подогревание жиромеров с исследуемой смесью перед центрифугированием проводят в водяной бане при частом встряхивании до полного растворения белка; уровень смеси в жиромере устанавливают на 4–5 мм ниже основания горловины жиромера.

2. Молоко обезжиренное. Условия проведения измерений соответствуют требованиям таблицы 6. В два жиромера, горловины которых со стороны градуированной части закрыты пробками, осторожно, стараясь не смочить горловину, отмеривают серную кислоту. Затем отмеривают исследуемый продукт в каждый жиромер при помощи пипетки вместимостью 10,77 мл (по 2 раза), осторожно сливая его по стенке жиромеров. Дозатором добавляют в жиромеры по 2 мл изоамилового спирта. Жиромеры закрывают большими пробками и встряхивают до полного растворения белковых веществ, время от времени переворачивая.

Жиромеры устанавливают большой пробкой вниз на 5 мин. в водяную баню температурой 65±2°С. Вынув из бани, жиромеры устанавливают в центрифугу градуированной частью к центру. Центрифугируют три раза по 5 мин. или два раза по 10 мин. Между центрифугированием жиромеры термостатируют по 5 мин. в водяной бане при температуре 65±2°С. После первого центрифугирования, для облегчения регулирования уровня жира в жиромере, маленькую пробку слегка приоткрывают, не вынимая ее полностью. С помощью большой пробки устанавливают верхний уровень жидкости в градуированной части жиромера.

Затем меньшее отверстие плотно закрывают. Обычно после первого центрифугирования заметного отделения жира не наблюдают. После второго центрифугирования и выдерживания в водяной бане проверяют положения уровня жидкости. После третьего центрифугирования вынимают из жиромеров маленькие пробки, помещают на 5 мин. в водяную баню при температуре 65±2°С и следят, чтобы уровень жидкости не поднимался выше делений шкалы. Вынув жиромер из бани и, регулируя большой пробкой, устанавливают нижнюю границу жира на нулевом или ближайшем целом делении шкалы и быстро производят отсчет жира.

За результат измерений принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных наблюдений.

При работе с серной кислотой следует проявлять особую осторожность и соблюдать следующие правила:

• наполнять жиромер следует в строго указанной последовательности: кислота→молоко→спирт. Если в жиромер влить сначала молоко, а потом серную кислоту, то в узкой части прибора образуется пробка свернувшихся белков и анализ придётся повторить. Если же смешать спирт с кислотой, то образуется ряд нерастворимых соединений, искажающих результат анализа;
• поскольку смешивание крепкой кислоты и молока приводит к сильному нагреванию жидкости, жиромер следует предварительно укрепить в штативе и заполнять кислотой только над кюветами;
• если при заполнении жиромера горлышко оказалось смоченным серной кислотой, то для нейтрализации кислоты пробку с поверхности надо покрыть мелом (продольными штрихами) и только после этого закрыть жиромер пробкой;
• содержимое жиромера встряхивать только при закрытой пробке, предварительно завернув его в полотенце или тряпку. При этом отверстие жиромера направлять в сторону от себя и окружающих;
• после окончания определения жира содержимое жиромера тщательно перемешать и вылить в еще теплом состоянии в специально предназначенные склянки с этикетками (но не в раковину!);
• в случае попадания кислоты на кожу немедленно промыть пораженное место водой, а затем 3% раствором двууглекислой соды.

Определение качества и плотности серной кислоты

Серная кислота, применяемая при определении жира в молоке, должна быть прозрачной и не содержать примесей. Допускается слабое окрашивание ее в буроватый цвет. Для проверки ее качества в жиромер налить 11 мл исследуемой кислоты и 11 мл воды. Жиромер закрыть пробкой, взболтать содержимое и центрифугировать 5 мин., при 100 об/мин. Затем выдержать 5 мин. жиромер в воде при 65±2°С, после чего повторить центрифугирование.

Если при этом на поверхности смеси в узкой части жиромера не выделится жироподобной слой, кислота пригодна для работы. Плотность серной кислоты определяется ареометром, имеющим шкалу с делениями от 1,40 до 1,85. При отсутствии ареометра плотность кислоты можно определить весовым способом, а именно: на технохимических весах взвесить с точностью до 0,01 г чистую сухую мерную колбу определенной емкости (от 50 до 100 мл), заполнить ее до метки дистиллированной водой при 20°С и снова взвесить. Вылить воду, колбу ополоснуть проверяемой кислотой, заполнить кислотой до метки также при 20°С и взвесить. Рассчитать плотность кислоты по формуле

П= [(в – а /(б – а)] х 0,99823,

где а – масса чистый навески, г; б – масса колбы с водой, г; в – масса колбы с серной кислотой, г; 0,99823 – постоянная величина.

Чтобы получить серную кислоту нужной концентрации, можно воспользоваться таблицей 2.

Таблица 2. Разведение серной кислоты

Плотность серной кислоты, г/мл	Требуется мл воды на 1 мл имеющейся кислоты для получения кислоты плотностью:
	1,82 (молоко)	1,50 (молочные продукты)
1,840	113	1105
1,837	85	1063
1,835	69	1036
1,831	46	1000
1,825	19	956
1,820	–	925
1,815	–	892
1,790	–	777
1,750	–	640
1,700	–	497
1,650	–	362
1,600	–	236
1,550	–	118

Разбавлять серную кислоту водой нужно очень осторожно, в тонкостенной стеклянной посуде, так как соединение воды с кислотой сопровождается выделением тепла, и посуда из толстого стекла может лопнуть. При разбавлении нужно кислоту осторожно по стенке сосуда вливать небольшими порциями в воду (нельзя вливать воду в кислоту), перемешивая содержимое колбы кругообразными движениями. В стакане смесь размешивают стеклянной палочкой.

Определение качества и плотности изоамилового спирта. В изоамиловом спирте не должно быть посторонних примесей. Для проверки его качества в жиромер налить 10 мл серной кислоты плотностью от 1,81 до 1,82 г/мл, 10,77 мл воды и 1 мл проверяемого изоамилового спирта. Жиромер закрыть резиновой пробкой, хорошо взболтать и оставить в штативе на 24 часа для отстаивания. Если на поверхности жидкости в жиромере не выделится маслянистый слой, то спирт пригоден для анализа.

Возможен иной способ проверки качества спирта – определить содержание жира в молоке с заведомо годным спиртом и проверяемым. Если результаты отсчета совпадают, то спирт пригоден для анализа. Разница в определении допускается ±0,05 деления шкалы жиромера. Плотность спирта определяется ареометром (для жидкостей плотностью менее 1,0 г/мл).

1.4. Оптический (турбидиметрический) метод определения массовой доли жира в молоке (ГОСТ 5867)

Метод основан на фотометрическом измерении степени ослабления лучистого потока светорассеяния слоем жировых шариков молока, молочного напитка. Действует только на территории Российской Федерации.

2. Белки молока

Белки молока являются наиболее значимой составляющей его химического состава как с точки зрения биологической ценности, так и с позиций технологии переработки.

В коровьем молоке среднего состава содержится 3,3% белков, в т.ч. казеинов – 2,7 (2,3–2,9), α-лактальбуминов – 0,5% и β-лактоглобулинов – 0,1%. Наибольшее практическое значение имеет казеин, на использовании которого основано производство сыров и творожных изделий.

В настоящее время применяются следующие методы определения общего количества белков в молоке и молочных продуктах согласно ГОСТ Р 52054: формольного титрования, колориметрический, Кьельдаля и инструментальный.

2.1. Определение массовой доли белка методом формольного титрования (ГОСТ 25179)

Метод распространяется на непастеризованное молоко с титруемой кислотностью не выше 20°Т, применяют при условии согласования с поставщиком. Метод основан на нейтрализации карбоксильных групп моноаминодикарбоновых кислот белков раствором гидроксида натрия, количество которого, затраченное на нейтрализацию, пропорционально массовой доле белка в молоке.

Оборудование, материалы, реактивы. Анализатор потенциометрический (или рН-метр), магнитная мешалка с частотой вращения 800 об./мин., секундомер, колбы, пипетки, воронки, стаканы (со шкалой), бюретки, натрия гидроокись (каустическая сода) или стандарт-титр (раствор молярной концентрации с NaОН, равной 0,1 моль/л), формальдегид (водный раствор с массовой долей формальдегида 36,5–37,5 %), вода дистиллированная.

Подготовка к проведению измерений

Приготовление раствора гидроокиси натрия молярной концентрации 0,1 моль/л и проверку его молярной концентрации проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 25794.1. Раствор хранят не более 1 мес. при температуре 20±5°С в бутыли из темного стекла.

Определение поправки к результатам измерения массовой доли белка методом формольного титрования. Для определения поправки к результатам измерения массовой доли белка методом формольного титрования проводят одновременное измерение массовой доли белка в одном и том же образце молока методом формольного титрования и методом Кьельдаля.

Измерения проводят в средней пробе молока, полученной смешиванием равных по массе образцов молока, полученных от разных хозяйств. При этом средняя проба должна быть образована не менее чем от 75% всех хозяйств-сдатчиков молока. Измерения проводят в шести повторностях, определяют среднеарифметические значения. Поправку К,%, вычисляют по формуле

К = Х₁ – Х₂,

где Х₁ – среднеарифметическое значение шести измерений массовой доли белка, полученное по Кьельдалю, %; Х₂ – среднеарифметическое значение шести измерений массовой доли белка, полученное формольным титрованием,%.

Определение поправки проводят не реже одного раза в десять дней.

Техника определения

В стакан помещают 20 мл молока и стержень магнитной мешалки. Стакан устанавливают на магнитную мешалку, включают двигатель мешалки и погружают электроды потенциометрического анализатора в молоко. Постепенно добавляют раствор гидроокиси натрия. При достижении точки эквивалентности (рН = 9) и истечении времени выдержки (30 с) после достижения точки эквивалентности определяют количество раствора гидроокиси натрия, пошедшее на нейтрализацию молока до внесения формальдегида. Затем вносят в стакан 5 мл формальдегида. По истечении 2,0–2,5 мин. продолжают титрование. По окончании процесса определяют общее количество раствора, затраченного на нейтрализацию.

Параллельно проводят 1 контрольный опыт по нейтрализации смеси, состоящей из 20 мл дистиллированной воды и 5 мл раствора формальдегида.

Обработка результатов. Массовую долю белка Х₃,%, вычисляют по формуле

Х₃ = (V₂ – V₁ – V₀) • 0,96 + К,

где V₂ – общее количество раствора, израсходованное на нейтрализацию, мл; V_{1 –} количество раствора, израсходованное на нейтрализацию до внесения формальдегида, мл; V₀ – количество раствора, израсходованное на контрольный опыт, мл; 0,96 – эмпирический коэффициент, %/ мл; К – поправка к результату измерения массовой доли белка,%.

За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов двух измерений.

2.2. Определение массовой доли белка колориметрическим методом (ГОСТ 25179)

Метод основан на способности белков молока при рН ниже изоэлектрической точки связывать кислый краситель, образуя с ним нерастворимый осадок, после удаления которого измеряют оптическую плотность исходного раствора красителя относительно полученного раствора.

Оборудование, материалы, реактивы. Весы неавтоматического действия; колориметр или спектрофотометр лабораторный; анализатор потенциометрический; термометр ртутный стеклянный; центрифуга с частотой вращения не менее 1000 об./мин.; мешалка магнитная с частотой вращения 800 об./мин.; баня водяная термостатируемая; часы электронно-механические; пробки резиновые конусные; штатив для пробирок; фильтры бумажные обеззоленные или бумага фильтровальная; пробирки; воронки; колбы; пипетки; цилиндр; колбы; краситель «Амидо черный 10 Б»; кислота лимонная; натрий фосфорнокислый двузамещенный; кислота серная; натрия гидроокись; раствор массовой доли 40 %; вода дистиллированная. (Методика приготовление растворов описана в приложении 8).

Проведение измерений. В стеклянную пробирку пипеткой отмеряют 1 мл молока, добавляют 20 мл раствора красителя и, закрыв пробирку резиновой пробкой, перемешивают содержимое, переворачивая пробирку от 2 до 10 раз. Следует избегать встряхивания, т.к. при этом образуется трудноразрушимая пена. Пробирку помещают в центрифугу и центрифугируют 10 мин. при частоте вращения 1500 об./мин или 20 мин. при частоте вращения 1000 об./мин. Отбирают пипеткой 1 мл надосадочной жидкости, переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доливают до метки дистиллированной водой и перемешивают. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 1 мл раствора красителя, объем раствора доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Измеряют оптическую плотность разбавленного раствора красителя по отношению к анализируемой пробе. После каждых 24 измерений кювету промывают буферным раствором.

Массовую долю белка Х₄,%, вычисляют по формуле

Х₄ = 7,78 D – 1,34,

где 7,78 – эмпирический коэффициент, %/ед. оптической плотности; D – измеренная оптическая плотность, ед. оптической плотности; 1,34 – эмпирический коэффициент,%.

За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов измерений, выполненных в условиях повторяемости, округленное до второго десятичного знака

2.3. Определение массовой доли белка по Кьельдалю (ГОСТ 23327)

Метод Кьельдаля основан на минерализации пробы молока концентрированной серной кислотой в присутствии окислителя, инертной соли – сульфата калия и катализатора – сульфата меди. При этом аминогруппы белка превращаются в сульфат аммония, растворенный в серной кислоте. Массовую долю азота в этом растворе измеряют одним из следующих способов:

• химическим — путем подщелачивания раствора, дистилляции аммиака с водяным паром, поглощения его раствором борной кислоты и титрования последнего раствором соляной кислоты с индикацией точки эквивалентности по изменению окраски индикатора (ручное титрование) или с помощью потенциометрического анализатора (ручное или автоматическое титрование);
• электрохимическим – путем автоматического кулонометрического титрования аммиака непосредственно в минерализованной пробе. Массовую долю белка определяют, умножая полученный результат на соответствующий коэффициент.

Метод используют для проведения государственных испытаний приборов, а также при разработке ускоренных методов определения жира и в спорных случаях.

Оборудование, материалы, реактивы. Для измерений применяют: весы лабораторные с наибольшим пределом взвешивания 200 г; весы лабораторные 4-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 500 г; анализатор потенциометрический с диапазоном измерения 0–12 ед. рН, с ценой деления 0,05 ед. рН; блок автоматического титрования, аппаратурно-совместимый с потенциометрическим анализатором и имеющий дозатор раствора – бюретку вместимостью не менее 5 мл, с ценой деления не более 0,02 мл, а также магнитную мешалку; автоматический кулонометрический титратор общего назначения с диапазоном измерения 0,1–0,4 Кл (класса точности) и ценой деления не более 0,005 Кл или автоматический кулонометрический титратор для измерения массовой доли общего азота с диапазоном измерения 0–1% азота и ценой деления не более 0,01% азота; термометр ртутный стеклянный с диапазоном измерения 0–40°С и ценой деления 0,1°С; плитка электрическая; блок с гнездами алюминиевый для пробирок или колб Кьельдаля; шкаф вытяжной; приспособление для отвода кислотных паров, выделяющихся при минерализации (рис. 4); колбы Кьельдаля; пробирки кварцевые.

Рис. 2. Приспособление для отвода кислотных паров: 1 – пробирка или колба Кьельдаля; 2 – стеклянный колпак; 3 – трубка из резины или фторопласта-4; 4 – водоструйный насос

или пробирки из термостойкого стекла; каплеуловитель лабораторный стеклянный; колбы мерные на 250, 500, 1000, 2000 мл, цилиндры мерные на 10, 50, 100, 1000 мл; пипетки; бюретки; колбы конические; стаканы; стаканчики; воронки делительные; ступка фарфоровая с пестиком; отрезки стеклянных трубок длиной 2–3 см, диаметром 0,5 см; кислота серная концентрированная, плотностью 1,83–1,84 г/мл; кислота соляная, раствор концентрации 0,1 моль/л; кислота соляная; кислота борная; натрия гидроокись; калия бромид; калия карбонат; калия гидрокарбонат; калия сульфат; калия перманганат; медь сернокислая, 5-водная; перекись водорода, раствор с массовой долей 30 %; ацетон; вода дистиллированная; метиленовый голубой; бриллиантовый зеленый; метиловый красный; бромкрезоловый зеленый.

Техника определения

В колбу Кьельдаля или пробирку помещают несколько отрезков стеклянных трубок и 10 г смеси солей. В стаканчик для взвешивания отмеряют 1 мл продукта, крышку закрывают и взвешивают. Продукт переливают в колбу Кьельдаля или пробирку. Пустой стаканчик с крышкой вновь взвешивают и по разнице между массой стаканчика с молоком и массой пустого стаканчика устанавливают массу взятого продукта. В колбу Кьельдаля или пробирку добавляют 10 мл серной кислоты и 10 мл перекиси водорода или 0,5 г перманганата калия. Колбу Кьельдаля или пробирку помещают в гнездо алюминиевого блока на электроплитке. Устанавливают регулятор нагрева плитки в среднее положение.

После прекращения бурного вспенивания содержимого колбы или пробирки (приблизительно через 10 мин. после начала нагревания) устанавливают регулятор нагрева плитки в положение, соответствующее максимуму. Нагревание продолжают до тех пор, пока жидкость не станет прозрачной и бесцветной или слегка голубоватой. Колбу Кьельдаля или пробирку с полученным минерализатом охлаждают на воздухе до комнатной температуры. Измерение массовой доли общего азота химическим способом с индикацией точки эквивалентности по изменению окраски индикатора проводят в следующей последовательности. В колбу Кьельдаля или пробирку с минерализатом добавляют 20 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивают круговым движением до растворения осадка. Собирают перегонный аппарат (рис. 8).

Рис. 3. Прибор для отгонки аммиака: 1 – плитка электрическая; 2 – колба коническая вместимостью 2 л; 3 – воронка делительная; 4 – каплеуловитель; 5 – пробирка кварцевая; 6 – холодильник; 7 – колба коническая вместимостью 250 мл

Включают электроплитку под колбой-парообразователем, открывают зажим на линии отвода пара в канализацию и закрывают зажим на линии подачи пара в колбу Кьельдаля. Нагревают воду в колбепарообразователе до кипения. Колбу Кьельдаля или пробирку присоединяют к перегонному аппарату.

В коническую колбу вместимостью 250 мл отмеривают мерным цилиндром 20 мл смеси раствора борной кислоты с раствором индикатора. Устанавливают коническую колбу на поз. 7 (рис. 5) так, чтобы конец трубки холодильника находился ниже верхнего уровня смеси растворов в колбе. Отмеряют мерным цилиндром 50 мл раствора гидроокиси натрия и осторожно, не допуская выбросов, переливают его через делительную воронку в колбу Кьельдаля или пробирку.

Кран воронки сразу закрывают. Закрывают зажим на линии отвода пара и открывают зажим на линии подачи пара из колбы-парообразователя в колбу Кьельдаля или пробирку. Перегонку ведут до достижения объема конденсата 90–120 мл (время перегонки – 5–10 мин.). Температура воды на выходе из холодильника не должна превышать 25°С. Содержимое конической колбы с раствором индикатора, борной кислоты и конденсатом титруют раствором соляной кислоты концентрацией 0,2 моль/л до изменения цвета, указанного в таблице 8.

Таблица 3. Изменение цвета раствора при титровании с различными индикаторами

Индикатор	Цвет раствора
	исходный	в точке эквивалентности	при избытке титранта
Метиленовый голубой	Зеленый	Серый	Фиолетовый
Бромкрезоловый зеленый и бриллиантовый зеленый	Зеленый	Серо-желтый	Красный

Проводят отсчет объема кислоты, затраченного на титрование содержимого колбы.

Аналогичные операции проводят при измерении массовой доли общего азота химическим способом с индикацией точки эквивалентности с помощью потенцеметрического анализатора (ручное титрование).

В химический стакан вместимостью 250 мл отмеривают мерным цилиндром 20 мл раствора борной кислоты и устанавливают стакан на поз.7 (рис. 5) так, чтобы конец трубки холодильника находился ниже верхнего уровня раствора в стакане. Химический стакан снимают с поз.7 и погружают в него электроды потенциометрического анализатора с раствором борной кислоты и конденсатом, титруют содержимое стакана раствором соляной кислоты концентрации 0,2 моль/л до достижения рН = 5,4. Проводят отсчет объема кислоты, затраченного на титрование содержимого стакана. Подключают блок автоматического титрования к потенциометрическому анализатору согласно инструкции, прилагаемой к блоку.

Подключают блок и анализатор к сети и прогревают в течение 10 мин. Заполняют дозатор блока автоматического титрования раствором соляной кислоты концентрации 0,2 моль/л. Настраивают потенциометрический анализатор на диапазон, включающий значение рН = 5,4. Настраивают блок автоматического титрования на точку эквивалентности, равную 5,4, и устанавливают на блоке значение рН = 10,4, начиная с которого подача соляной кислоты должна вестись по каплям. Устанавливают время выдержки после окончания титрования – 15 с. В химический стакан со смесью конденсата и раствором борной кислоты помещают стержень магнитной мешалки. Включают двигатель мешалки и погружают электроды потенциометрического анализатора и сливную трубку дозатора блока автоматического титрования в содержимое химического стакана.

Включают кнопку «Пуск» блока автоматического титрования, а спустя 2–3 с – кнопку «Выдержка». Раствор соляной кислоты при этом начинает поступать из дозатора блока в стакан с конденсатом, нейтрализуя последний. По достижении точки эквивалентности и истечении времени выдержки 15 с процесс нейтрализации автоматически прекращается, а на панели блока автоматического титрования зажигается сигнал «Конец». После этого отключают все кнопки. Фиксируют объем раствора кислоты, затраченного на нейтрализацию. Для измерения массовой доли общего азота электрохимическим способом проводят операции: в колбу Кьельдаля или пробирку помещают несколько отрезков стеклянных трубок и 10 г смеси солей. В стаканчик для взвешивания отмеряют 1 мл продукта, крышку закрывают и взвешивают. Продукт переливают в колбу Кьельдаля или пробирку.

Пустой стаканчик с крышкой вновь взвешивают и по разнице между массой стаканчика с молоком и массой пустого стаканчика устанавливают массу взятого продукта. В колбу Кьельдаля или пробирку добавляют 10 мл серной кислоты и 10 мл перекиси водорода или 0,5 г перманганата калия. Колбу Кьельдаля или пробирку помещают в гнездо алюминиевого блока на электроплитке. Устанавливают регулятор нагрева плитки в среднее положение. После прекращения бурного вспенивания содержимого колбы или пробирки (приблизительно через 10 мин. после начала нагревания) устанавливают регулятор нагрева плитки в положение, соответствующее максимуму. Нагревание продолжают до тех пор, пока жидкость не станет прозрачной и бесцветной или слегка голубоватой. Колбу Кьельдаля или пробирку с полученным минерализатом охлаждают на воздухе до комнатной температуры.

Минерализат после охлаждения количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, объем раствора доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.

В измерительную ячейку титратора, заполненную анодным раствором, вносят 0,2 мл нейтрализующего раствора, а затем – 0,1 мл раствора минерализата и включают кнопку «Пуск» автоматического титрования (некоторые модификации кулонометрического титратора начинают титрование автоматически после внесения раствора минерализата).

Процесс титрования аммиака проводят автоматически. По окончании процесса прибор отключается. Показания цифрового индикатора соответствуют значению массы общего азота в пробе или значению количества электричества, затраченного на окисление аммиака (в зависимости от модификации прибора). Периодически, не реже двух раз в день и при замене хотя бы одного из реактивов, необходимо проводить контрольное измерение, используя вместо продукта 1 мл дистиллированной воды.

Количество повторов контрольного измерения должно быть не менее 5. При появлении одного из значений, отличающегося от нуля, проводят замену реактивов и повторное контрольное измерение.

Обработка результатов измерений

Массовую долю общего азота Х,%, при химическом способе измерения вычисляют по формуле

Х = 1,4 (V₁ – V₂) • с / m,

где V₁— объем кислоты, затраченный на титрование, мл;

V₂ – объем кислоты, затраченный на титрование при контрольном измерении, мл;

c – концентрация соляной кислоты, моль/л;

m – масса навески продукта, г;

1,4 – коэффициент пересчета объема кислоты в массовую долю общего азота,% г•л/моль•мл.^.

Массовую долю белка Y,%, определяют по формуле

Y = 6,38 • Х,

где 6,38 – масса молочного белка, эквивалентная единице массы общего азота.

Массовую долю общего азота Х,%, при электрохимическом способе измерения вычисляют по формуле, приведенной в паспорте на прибор. В таблице 9 приведены метрологические характеристики методик измерения массовой доли общего азота и определения массовой доли белка, где установлены: границы абсолютной погрешности измерений при доверительной вероятности Р = 0,95.

Таблица 4. Метрологические характеристики измерения массовой доли общего азота и определения массовой доли белка, %

Способ измерения	Границы абсолютной погрешности измерений		Сходимость, не более		Воспроизводимость, не более
	массовых долей
	азота	белка	азота	белка	азота	белка
Химический	±0,009	±0,06	0,013	0,08	0,026	0,16
Электрохимический	±0,013	±0,08	0,015	0,11	0,30	0,22

За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных измерений, округленное до второго знака после запятой.

3. Небелковый азот, мочевина, истинный белок

Небелковые азотсодержащие соединения представляют собой промежуточные и конечные продукты обмена веществ, которые попадают в молоко напрямую через систему кровообращения или из тканей молочных желез животного. Содержание их в секрете соответствует примерно 2–6% общего количества азота, определяемого по Кьельдалю. Их концентрация зависит от стадии лактации, породы животных и кормов. К фракции небелкового азота молока относятся свободные аминокислоты, пептиды, мочевина, креатин, креатинин, аммиак, оротовая, мочевая и гиппуровая кислоты.

Мочевина (H₂N–CO–NH₂) является основной составной частью фракции небелковых азотсодержащих соединений. Содержание мочевины в молоке коррелирует с содержанием мочевины в крови. Слишком высокое поступление белков, при недостаточной энергетической ценности корма, приводит к значительному повышению содержания мочевины в молоке. Так как избыток аммиака в рубце коровы не может быть использован для синтеза белка, вследствие недостатка энергии, он преобразуется в мочевину. С целью увеличения содержания белка в молоке в рацион включают азотсодержащие добавки (небелковый азот).

Азот попадает в молоко из корма, в результате увеличивается содержание небелкового азота (неорганического происхождения), который не усваивается человеческим организмом. Максимально допустимая концентрация небелкового азота в сыром молоке не должна превышать 0,038%, мочевины – 40 мг%. Более высокая концентрация этих веществ свидетельствует о фальсификации молока на стадии кормления животных. В этой связи ГОСТ 52054 устанавливает контроль в сыром молоке над небелковым азотом (ГОСТ Р 55246), содержанием мочевины (ГОСТ Р 55282) и истинного белка (ГОСТ Р 52054, пункт 6.26).

3.1. Небелковый азот с применением метода Кьельдаля (ГОСТ Р 55246)

Метод основан на предварительном осаждении белковых азотистых веществ трихлоруксусной кислотой, минерализации полученного фильтрата концентрированной серной кислотой в присутствии катализатора с образованием сернокислого аммония, переведении его в аммиак, отгонке последнего в раствор борной кислоты, количественном учете аммонийных соединений титриметрическим методом и расчете содержания массовой доли небелкового азота в анализируемой пробе продукта.

Оборудование, материалы, реактивы. Весы неавтоматического действия; весы со значением СКО; термометр лабораторный жидкостный; секундомер; плитка электрическая; электронагреватели или газовые горелки; баня водяная термостатируемая; колбы мерные на 100, 500, 1000 мл; цилиндры мерные по 25, 50, 1000 мл; пипетки вместимостью 5, 20 и 25 мл; бюретки 25 мл; холодильник шариковый или с прямой трубкой; бачок-парообразователь или колба из термостойкого стекла вместимостью 2000 мл; колбы Кьельдаля; пробирки из кварцевого стекла; каплеуловитель исполнения КО-60; колбы конические вместимостью 250, 500 и 1000 мл; колбы плоскодонные с притертыми пробками вместимостью 500 мл; стаканы стеклянные лабораторные; воронки; ступка фарфоровая с пестиком; стакан фарфоровый вместимостью 1000 мл; капельница стеклянная лабораторная; палочки стеклянные оплавленные; шпатель металлический или ложка; бумага фильтровальная лабораторная; бромкрезоловый зеленый; калий сернокислый; кислота серная концентрированная; кислота соляная; стандарт-титр; водный раствор молярной концентрации с НCl = 0,1 моль/л; кислота борная; медь сернокислая 5-водная; метиленовый голубой; метиловый красный; водород перекись (30%-ный раствор); натрия гидроокись; сахароза, содержащая не более 0,002% азота; спирт этиловый ректификованный; кислота трихлоруксусная; водный раствор с объемной долей уксусной кислоты 10 %; вода дистиллированная.

Подготовка прибора для отгонки аммиака Прибор для отгонки аммиака собирают согласно рис. 4.

Рис. 4. Схема прибора для отгонки аммиака методом Кьельдаля: 1 – бачок-парообразователь (или колба из термостойкого стекла вместимостью 2000 мл); 2 – воронка; 3 – кран; 4 – зажим; 5 – воронка для гидроокиси натрия; 6 – кран; 7 – каплеуловитель; 8 – холодильник; 9 – коническая колба вместимостью 250 мл; 10 – колба Кьельдаля; 11 – плитка электрическая

В бачок-парообразователь 1 через воронку 2 наливают дистиллированную воду (примерно на 2/3 объема) и открывают кран 3 и зажим 4. Нагревают воду в бачке на газовой горелке или электрической плитке 11. Присоединяют пустую колбу Кьельдаля или кварцевую пробирку 10 к каплеуловителю 7 и воронке для гидроокиси натрия 5 и после того, как вода в бачке закипит, закрывают кран 3. Включают холодильник 8, подставляют под него пустую коническую колбу вместимостью 250 мл 9 и «пропаривают прибор» 5–10 мин. Возможно применение автоматического или полуавтоматического прибора для перегонки.

Подготовка прибора проводится в соответствии с инструкцией о применении. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 20,0 г анализируемого продукта, добавляют небольшое количество 15%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят 15%-ным раствором трихлоруксусной кислоты до метки и оставляют в покое на 10–15 мин. После расслоения надосадочную жидкость фильтруют через сухой бумажный складчатый фильтр. Фильтрат должен быть прозрачным, без наличия каких-либо частиц.

Техника измерения

В колбу Кьельдаля или кварцевую пробирку помещают 20 г фильтрата. Добавляют 1,50–2,0 г смешанного катализатора и затем осторожно приливают 10 мл концентрированной серной кислоты и 10 мл 30 %-ной перекиси водорода. Колбу прикрывают насадкой или стеклянной воронкой, кварцевую пробирку прикрывают специальным каплеуловителем и приступают к нагреванию в наклонном положении под углом 45° при температуре от 450 до 500°С.

Необходимо следить, чтобы жидкость в колбе (пробирке) непрерывно кипела и на стенках колбы (пробирки) не оставалось черных несгоревших частиц, смывая их легкими круговыми движениями. При наличии черных частиц на горловине колбы (пробирки), если они не захватываются конденсатом паров кислоты в период кипения или кислотой при перемешивании содержимого колбы, следует хорошо охладить колбу (пробирку), смыть эти частицы в колбу небольшим количеством воды, затем продолжить сжигание.

После того как жидкость в колбе (пробирке) обесцветится (допускается слегка зеленоватый оттенок), нагрев продолжают еще в течение 30 мин. Дают колбе (пробирке) остыть до температуры 20±5°С, затем к содержимому приливают, обмывая стенки колбы, от 20 до 30 мл дистиллированной воды и приступают к отгонке аммиака. После подготовки прибора открывают краны 3 и 6 и закрывают зажим 4. Под холодильник вместо пустой колбы подставляют колбу с 25 мл борной кислоты и пятью каплями смешанного индикатора так, чтобы кончик холодильника был погружен в раствор.

Вместо пустой колбы Кьельдаля присоединяют колбу или пробирку с минерализованной пробой. Закрывают кран 6, наливают в воронку 60 мл раствора гидроокиси натрия и, открывая понемногу кран 6 при осторожном покачивании колбы Кьельдаля или пробирки, вливают гидроокись натрия. Открывая зажим 4, закрывают краны 3 и 6. В холодильнике пары раствора аммиака конденсируются и попадают в колбу с раствором борной кислоты.

Перегонку ведут до достижения объема конденсата 90−120 мл (время перегонки примерно 10 мин.). После окончания отгонки конец трубки холодильника вынимают из борной кислоты, ополаскивают и продолжают процесс перегонки еще 2 мин. Затем открывают краны 3 и 6, закрывают зажим 4. При использовании автоматических приборов для перегонки процесс проводят согласно прилагаемой инструкции по применению.

Содержимое приемной колбы титруют водным раствором соляной кислоты молярной концентрации с НCl = 0,1 моль/л до перехода окраски индикатора от зеленой к серо-фиолетовой (при использовании в качестве индикатора метиленового голубого) или от зеленой к серо-желтой (при использовании в качестве индикатора бромкрезолового зеленого).

Пробу анализируют два раза в условиях повторяемости. Для внесения соответствующей поправки на реактивы в результат измерения проводят определение массовой доли азота в контрольной пробе, используя вместо анализируемой пробы 1 мл дистиллированной воды и 0,1 г сахарозы. Определение массовой доли азота в контрольной пробе проводят по трем параллельным определениям. За окончательный результат определения поправки на реактивы принимают среднеарифметическое значение результатов трех параллельных определений, округленное до второго десятичного знака. Контрольную пробу применяют при замене хотя бы одного из реактивов.

Обработка результатов измерений. Массовую долю небелкового азота Х,%, в анализируемой пробе вычисляют по формуле

где V – объем раствора соляной кислоты, израсходованной на титрование анализируемого раствора, мл;

V₁ – объем раствора соляной кислоты, израсходованной на титрование в контрольном опыте, мл;

n – фактическая молярная концентрация соляной кислоты, моль/л; 14,0067 – масса азота, эквивалентная 1 л раствора соляной кислоты с молярной концентрацией c (HCl) = 1 моль/л, г;

100 – коэффициент пересчета в проценты; m – масса анализируемой пробы, г;

1000 – коэффициент пересчета кубических сантиметров в кубические дециметры.

За окончательный результат определения массовой доли небелкового азота в продукте принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, округленное до второго десятичного знака.

3.2. Колориметрический метод определения содержания мочевины (ГОСТ Р 55282)

Колориметрический метод – метод, основанный на измерении поглощения света окрашенными растворами в видимой части спектра с помощью фотоэлементов. Он основан на взаимодействии мочевины с диацетилмоноксимом в кислой среде в присутствии тиосемикарбазида и трехвалентного железа с образованием окрашенного комплекса. Количество мочевины определяют колориметрическим методом.

Аппаратура, материалы и реактивы. Весы со значением СКО, колориметр фотоэлектрический спектральным диапазоном измерения от 315 до 980 нм, с кюветами рабочей длиной 5 мм, термометр жидкостной, баня водяная термостатируемая, центрифуга с частотой вращения не менее 1000 об/мин, часы электронно-механические, колбы мерные, пипетки, цилиндры, воронка, колбы конические, пробирки, бумага фильтровальная, фольга алюминиевая для технических целей, диацетилмоноксим массовой долей основного вещества не менее 99,98%, железо (III), хлорид 6-водный, карбамид (мочевина), кислота серная, кислота трихлоруксусная, спирт этиловый ректификованный, тиосемикарбазид гидрохлорид, вода дистиллированная. (Методика приготовление растворов описана в приложении 8).

Проведение измерений. Пробу анализируют два раза в условиях повторяемости. В стеклянную пробирку вместимостью 10 мл пипеткой вносят в зависимости от содержания мочевины 0,25 или 0,5 мл фильтрата и 5 мл рабочего раствора реактивов. Подготовленную анализируемую пробу тщательно перемешивают.

Пробирки с анализируемой пробой, контрольной пробой и калибровочной пробой закрывают крышками из алюминиевой фольги и нагревают (выдерживают) на кипящей водяной бане в течение 10 мин. В результате в пробирках с анализируемой и калибровочной пробами появляется розовое окрашивание, стабильное в течение 15 мин. По окончании нагрева пробы охлаждают под холодной проточной водой и измеряют оптическую плотность анализируемой пробы и калибровочной пробы относительно контрольной пробы. Измерение оптической плотности проводят в кюветах рабочей длиной 5 мм при длине волны 540 нм не позднее чем через 15 мин. после выдерживания на кипящей водяной бане.

Обработка результатов измерений. Молярную концентрацию мочевины в анализируемой пробе С, ммоль/дм³, определяют по формуле

где 8,33 – молярная концентрация мочевины в калибровочном растворе, ммоль/л.

D₁ – оптическая плотность анализируемой пробы, отн. ед.; D₂ – оптическая плотность калибровочной пробы, отн. ед.

При необходимости вычисляют массовую долю мочевины в молоке M, мг%, по формуле

М = С • 6,

где 6 – коэффициент пересчета кубических миллимолей в миллиграммы проценты (6 мг% = 1 ммоль/л).

За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, округленное до второго десятичного знака.

3.3. Определение массовой доли истинного белка. (ГОСТ Р 52054, пункт 6.26)

Истинный белок – разность между массовой долей общего азота и небелкового азота, умноженная на коэффициент 6,38″.

Массовую долю истинного белка (ИБ),%, вычисляют по формуле

ИБ = (ОА − НБА) • 6,38,

где ОА – содержание общего азота, %; НБА – содержание небелкового азота, %; 6,38 – коэффициент пересчета массовой доли азота на массовую долю белка.

4. Технологические свойства белков

Определение казеина методом формольного титрования

Метод основан на том, что водный нейтральный раствор аминокислот в присутствии нейтрального формалина способен повышать кислотность с образованием соединений, в которых оба водорода аминогруппы замещаются метильной группой.

Оборудование, материалы и реактивы. Бюретки; колбы вместимостью 50−100 мл; пипетки вместимостью 10 мл; фенолфталеин, 1%-ный спиртовой раствор; гидроокись натрия концентрацией 0,1 моль/л; спирт этиловый; вода дистиллированная; 30−40%-ный раствор формалина.

Техника определения

В колбу на 50−100 мл отмеряют пипеткой 10 мл молока, добавляют 10 капель 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина, все размешивают и титруют 0,1 н. (децинормальным) раствором щелочи до слабо-розового окрашивания, не исчезающего при взбалтывании. Затем в колбу добавляют 2 мл нейтрализованного формалина. Слабо-розовое окрашивание исчезает.

В бюретке отмечают уровень щелочи и вновь титруют содержимое колбы до слабо-розового окрашивания.

Делают отсчет по бюретке, показывающий количество щелочи, пошедшей на титрование, и рассчитывают общее содержание белка и казеина в молоке. Для установления содержания общего белка количество щелочи, пошедшей на титрование после добавления формалина, умножают на коэффициент 1,94, а для определения казеина – на коэффициент 1,51.

Пример. После добавления формалина на титрование содержимого колбы пошло 1,9 мл 0,1 н. раствора NaOH. Следовательно, количество общего белка в молоке составит 1,9∙1,94 = 3,68%. Содержание казеина: 1,9 ∙ 1 , 51= 2,86%.

Выделение казеина

• а) сычужным ферментом. В фарфоровую чашку отмерить 40– 60 мл молока (температура 35–40°С), прилить при быстром перемешивании 5 мл 2%-ного раствора сычужного фермента и оставить в покое на 2–3 мин., а затем наблюдать за появлением сгустка;
• б) кислотой. В колбу отмерить пипеткой 10 мл молока и 50 мл дистиллированной воды, размешать и из бюретки прибавить по каплям 6%-ную уксусную кислоту до появления хлопьев казеина. Осадок казеина отфильтровать.

Выделение альбуминов и глобулинов

Нагреванием 5–10 мл прозрачного фильтрата, полученного при выделении казеина, вскипятить в пробирке, наблюдая появление мути, а зачем коагуляцию альбуминов и глобулинов. Наличие этих белков свидетельствует об отсутствии пастеризации молока.

5. Влага и сухое вещество молока

Вода, содержащаяся в молоке в количестве 87–89%, является его доминирующей составной частью и жизненно необходимой для новорожденных. Вода – это химическое соединение с необычными свойствами. Все составляющие части молока диспергированы или растворены в воде и равномерно распределены в ней. Она стабилизирует диспергированное состояние структурных элементов молока, особенно молочных белков. Как среда она способствует химическим реакциям и принимает участие в гидролитических реакциях. Во всех агрегатных состояниях оказывает влияние на качество молочных продуктов.

Наиболее ценной частью молока является сухое вещество (сухой остаток). При производстве молочной продукции стремятся к максимальному его сохранению.

Сухой молочный остаток – все составные части молока, которые остаются после удаления из него влаги. В среднем в молоке коровы массовая доля сухого вещества – 12,5%. В него входят все составные части молока, за исключением воды и веществ, улетучивающихся при высушивании.

Сухой обезжиренный молочный остаток (СОМО) – составные части молока, за исключением жира и воды. Это показатель натуральности и полезности молока, в среднем он составляет 8,5% (колеблется от 6,6 до 10,3%). Так как наиболее изменчивой частью сухого остатка является жир, поэтому в практике чаще пользуются показателем СОМО.

5.1. Определение в молоке влаги и сухого вещества (ГОСТ 3626)

Сущность метода определения массовой доли влаги и сухого вещества в молоке заключается в высушивании навески исследуемого продукта при постоянной температуре.

Оборудование, материалы и реактивы. Весы лабораторные с ценой поверочного деления не более 0,001; шкаф сушильный; эксикатор; бюкса стеклянная; пипетки 10 мл; палочки стеклянные; прибор нагревательный; баня водяная; вода дистиллированная; вода питьевая; песок; проба молока.

Техника определения

Стеклянную бюксу с 20–30 г хорошо промытого и прокаленного песка и со стеклянной палочкой, не выступающей за края бюксы, помещают в сушильный шкаф и выдерживают при 102 ±2°C в течение 40 мин. После этого бюксу вынимают из сушильного шкафа, закрывают крышкой, охлаждают в эксикаторе 40 мин. и взвешивают с погрешностью не более 0,001 г. В эту же бюксу пипеткой вносят 3 мл молока, закрывают крышкой и взвешивают.

Содержимое перемешивают стеклянной палочкой. Открытую бюксу нагревают на водяной бане при частичном перемешивании содержимого до получения рассыпающейся массы.

Открытую бюксу и крышку помещают в сушильный шкаф с температурой 102±2°C. По истечении 2 ч. бюксу вынимают из сушильного шкафа, закрывают крышкой, охлаждают в эксикаторе 40 мин., взвешивают.

Взвешивание производят после высушивания в течение 1 ч. до тех пор, пока разность между двумя последовательными взвешиваниями будет равна или менее 0,001 г.

Содержание сухого вещества С,%, рассчитывают по формуле

где m_{0 –} масса стаканчика с марлей и крышкой, г;

m – масса стаканчика с марлей, крышкой и навеской молока до высушивания, г;

m₁ – масса стаканчика с марлей, крышкой и навеской молока после высушивания, г.

Расхождение между параллельными определениями должно быть для молока не более 0,1%.

Пример. Стаканчик с вложенными в него кружками марли и крышкой имел массу 38,20 г; масса стаканчика с крышкой, кружками марли и молоком до высушивания – 48,90 г; масса стаканчика с кружками марли, крышкой и молоком после высушивания 39,40 г. Следовательно, содержание сухого вещества составит

Массовую долю влаги в продуктах W,%, вычисляют по формуле

W=100 – С,

где С – массовая доля сухого вещества,%.

W = 100 – 11,21 = 88,79%.

6. Инструментальный экспресс-метод определения физико-химических показателей с применением инфракрасного анализатора

Согласно ГОСТ Р 52054-2003 одним из методов идентификации молока и молочных продуктов является инфракрасная спектроскопия (ГОСТ 32255). Метод основан на измерении интенсивности оптического излучения, отраженного от исследуемого образца или поглощенного исследуемым образцом, в инфракрасном диапазоне длин волн от 0,4 до 11,0 мкм и последующем пересчете полученной интенсивности в значения массовой доли белка, жира, лактозы, влаги и сухих веществ с помощью градуировочных моделей, полученных по набору образцов.

Оборудование, материалы, реактивы. ИК-анализатор; термометр жидкостной стеклянный; часы; баня водяная термостатируемая; гомогенизатор роторный с четырехлопастным ножом, угловой скоростью вращения ножей 1000-10000 мин^-1, включающий емкость вместимостью 0,5−1,0 л; стаканы объемом 100 и 600 мл; колба объемом 500 мл; устройство, измельчающее с диаметром решетки 2 мм или терка металлическая бытовая с мелкой перфорацией; сито с размером ячеек 0,2 мм; ложка или шпатель; вода дистиллированная.

Подготовка проб

Молоко сырое и жидкие негомогенизированные продукты. Пробу продукта помещают в лабораторный стакан вместимостью 600 мл, нагревают для растворения жира на водяной бане до температуры 40±2°С, после чего полностью переносят в стакан гомогенизатора и гомогенизируют в течение 1 мин. при частоте вращения ножей не более 1000 мин^-1 до получения однородной массы. Измерение проводят сразу же.

Гомогенизированные молоко, сливки и жидкие молочные продукты. Пробу продукта помещают в лабораторный стакан вместимостью 600 мл, нагревают до температуры 40±2°С, тщательно перемешивают и сразу же проводят измерение.

Подготовка ИК-анализатора к работе. Перед началом работы ИК-анализатор прогревают не менее 1 ч. Подготовку ИКанализатора, а также его предварительную градуировку и проверку градуировки проводят в соответствии с требованиями инструкции к прибору.

Градуировка ИК-анализатора. Базовые градуировки ИКанализатора для измерения показателей качества продукции являются частью программного обеспечения прибора и не требуют коррекции, если показания анализатора соответствуют требованиям, в части показателей: «Предел повторяемости» и «Границы абсолютной погрешности измерений при указанных диапазонах измерения». Если показания ИК-анализатора не соответствуют этим требованиям, проводят коррекцию базовых градуировок в соответствии с инструкцией к прибору.

Образцы для коррекции градуировки представляют собой образцы продукта с известными значениями измеряемых показателей, установленными следующими методами:

• определение массовой доли белка – по ГОСТ 23327;
• определение массовой доли жира – по ГОСТ 22760;
• определение массовой доли лактозы – по ГОСТ Р 54667;
• определение массовой доли влаги и сухого вещества – по ГОСТ 3626.

Проведение измерений. Проводят два параллельных измерения анализируемой пробы продукта в соответствии с инструкцией к прибору. Каждую параллельную пробу продукта загружают в измерительную ячейку и затем снимают показания прибора.

За окончательный результат измерения принимается среднее арифметическое значение результатов двух параллельных измерений, выполненных в условиях повторяемости.

В международной практике, и в том числе и в России, для определения состава и качества молока и молочной продукции в настоящее время применяют в основном инструментальные методы исследований, основанные на спектральном анализе в ближней инфракрасной (БИК) области (ИК-анализаторы) (табл. 5).

Таблица 5. Приборы для определения физико-химических показателей молока с применением инфракрасного анализатора

Наименование	Характеристика
«Лактан 1-4М»	«Лактан 1-М» МИНИ». Измеряемые параметры: жир, СОМО, плотность, добавленная вода. Время измерения: 3 мин.
	«Лактан 1-4М» 220. Измеряемые параметры: жир, СОМО, белок, плотность, добавленная вода. Время измерения: 3 мин.
	«Лактан 1-4М» исполнение 500 Стандарт. Измеряемые параметры: жир, СОМО, белок, плотность, добавленная вода. Время измерения: 2 мин.
	«Лактан 1-4М» исполнение 230. Измеряемые параметры: жир, СОМО, белок, плотность, добавленная вода, точка замерзания. Время измерения: 2 мин. 40 с.
«Лактан 1-4M» исполнение 600 УЛЬТРА	«Лактан 1-4M» исполнение 600 УЛЬТРА. Измеряемые параметры: массовая доля жира, белка, СОМО, лактозы, плотность, добавленная вода, температура. Время измерения: 40–50 с. Промывка автоматическая.
«Лактан 1- 4М»	Комплекс «Лактан 1-4М» исполнение 700. предназначен для использования на крупных комплексах и фермах. Комплексный анализ молока (массовая доля жира, белка, СОМО, добавленная вода и точка замерзания) выполняет в автоматическом режиме. Производительность 100 проб/ч.
«Клевер-2М»	Измеряемые параметры: массовая доля жира, белка, лактозы, минеральных солей, плотность. Рассчитывает массовую долю сухого молочного остатка, обезжиренного молочного остатка, степень гомогенизации, точку замерзания, количество добавленной воды. Время измерения: 3,5 мин.
«Funke-Gerber» (Германия).	Анализатор состава молока «FunkeGerber» (Германия). Измеряемые параметры: массовая доля жира, белка, лактозы, сухого остатка, точка замерзания вычисляется компьютером. Производительность 30 проб/ч.
«Bentley Combi» (США)	Комбинированные системы анализа молока «Bentley Combi». Измеряемые параметры: массовая доля жира, белка, сухих веществ, лактозы и количество соматических клеток. Молоко из пробы одновременно отбирается в инфракрасный анализатор и счетчик соматических клеток. Результат выводится на экран по всем оцениваемым параметрам молока. Используются в независимых лабораториях и в региональных селекционных лабораториях. Производительность 150–500 проб/ч.

7. Расчетный метод определения основных компонентов и энергетической ценности молока

Расчет основных компонентов молока

Для проведения расчетов основных компонентов молока вначале следует определить плотность и массовую долю жира.

а. Общая формула для расчета сухого вещества в молоке

Определив массовую долю жира и плотность по таблице приложений 3-6, можно рассчитать и количество сухого вещества в исследуемом образце молока при температуре 20ºС. В левой крайней графе таблицы указанного приложения находят строку со значением массовой доли жира, а в последующих графах – плотность. На пересечении соответствующей строки и графы находят значение сухого вещества.

б. Процентное содержание сухого обезжиренного молочного остатка вычисляют по формулам:

в. При расчете содержания лактозы в молоке используют формулу Я.С. Зайковского

Л = (Ж +А ) • О,135,

где 0,135 – постоянная величина.

г. При выводе расчетной формулы для определения белка в молоке исходят из постоянства соотношения между составными частями молока – белок : лактоза : зола = 9 : 13 : 2

Б = 0,075 Ж + 0,098 а + 0,085,

где 0,085 – постоянная величина.

д. Для определения количества золы используют формулу, предложенную профессором А.С. Крыловым

З = СОМО х 0,083,

где 0,083 – постоянная величина.

В приведенных формулах приняты следующие обозначения:

СВ – сухое вещество (%); СОМО – сухой обезжиренный молочный остаток (%), Л – лактоза (%), Ж- жир (%), Б – белок (%), З – зола (%), а – плотность молока, выраженная в градусах ареометра.

Пересчет молока фактической массовой доли жира в однопроцентное

Чтобы рассчитать количество 1%-ного молока (М_1%ж), или количество жировых единиц, необходимо количество молока (М_ф.ж) умножить на его массовую долю жира (Ж_ф)

М1%ж = Мф.ж × Жф .

Пример. Имеется 350 кг молока жирностью 3,5%. Количество 1%-ного молока (количество жировых единиц) будет равно

М_1%ж = 350 × 3,5 = 1225 кг, или 1225 ж. ед.

Данный расчет применяется при вычислении средней массовой доли жира и составлении жирового баланса.

Расчет количества чистого молочного жира и молочного белка

Чтобы рассчитать количество чистого молочного жира в молоке (Ж_ч.м), необходимо количество молока (М_ф.ж) умножить на его массовую долю жира (Ж_ф) и разделить на 100, или количество 1%-ного молока разделить на 100

Пример. Имеется 2000 кг молока массовой долей жира 3,6%.

Количество чистого молочного жира составит

Аналогичным образом рассчитывается количество молочного белка.

Расчет средней массовой доли жира и белка в молоке

Чтобы рассчитать среднюю массовую долю жира молока (Ж_ср.), необходимо количество 1%-ного молока разделить на количество молока

.

Пример. Необходимо рассчитать среднюю массовую долю жира в молоке, принятом на ферме за сутки, если утром надоено 2250 кг молока массовой долей жира 3,7%, а вечером – соответственно 2400 кг и 3,6%.

Средняя массовая доля жира молока составит

Аналогичным образом рассчитывается средняя массовая доля белка в молоке. Данная формула применяется также при определении средней массовой доли жира и белка молока за лактацию.

Расчет энергетической ценности молока

Энергетическая ценность – это количество энергии, которая образуется при биологическом окислении жиров, белков и углеводов, содержащихся в продуктах. Она выражается в килокалориях (ккал) или килоджоулях (кДж). Энергия, выделяемая при окислении 1 г жиров, равна 9,0 ккал, 1 г углеводов – 3,8 ккал, 1 г белков – 4,0 ккал. Для получения энергетической ценности в единицах системы СИ следует использовать коэффициент пересчета: 1 ккал = 4,184 кДж.

Пример расчета энергетической ценности 100 г молока приведены в таблице 6.

Таблица 6. Расчет энергетической ценности молока

Вещество, %	Энергетическая ценность 1 г		В 100 г молока содержится	Энергетическая ценность 100 г молока
	ккал	кДж		ккал	кДж
Жиры	9,0	37,656	4	36	150,624
Белки	4,0	16,736	3,2	12,8	53,5552
Углеводы	3,8	15,899	4,5	17,1	71,5464
Итого	х	х	х	65,9	275,725

Для расчета энергетической ценности молока надо массовые доли основных его веществ умножить на соответствующие энергетические коэффициенты и полученные результаты суммировать.