Эффективность пастеризации молока и молочных продуктов контролируют химическим методом по ГОСТ 3623. Химические методы основаны на определении присутствия пероксидазы и фосфатазы в сыром молоке и приготовленных из него продуктах и отсутствия этих ферментов в пастеризованном молоке и продуктах, выработанных из него.

Фосфатаза – фермент молока, относящийся к гидролазам, расщепляющий эфиры фосфорной кислоты, инактивирующийся при температуре пастеризации не ниже 63°С с выдержкой 30 мин.

Пероксидаза – фермент молока, относящийся к оксиредуктазам и инактивирующийся при температуре пастеризации не ниже 80°С с выдержкой 20–30 с.

1. Определение фосфатазы

1.1.  По реакции с 4-аминоантипирином

Сущность метода. Метод основан на гидролизе динатриевой соли фенилфосфорной кислоты ферментом фосфатазой, содержащейся в молоке и молочных продуктах.  Выделившийся при гидролизе свободный фенол в присутствии окислителя дает розовое окрашивание с 4-аминоантипирином.

Оборудование, материалы и реактивы. Весы неавтоматического действия; термометр лабораторный жидкостный диапазоном измерения температур от 0 до 100°С; часы электронномеханические; баня водяная термостатируемая; колбы мерные вместимостью 100 мл и 1 л; пипетки на 2 и 5  мл, цилиндры на 100 мл, колба коническая на 250 мл; воронка на 80 мл; пробирки и штатив для пробирок; бумага фильтровальная; бумага индикаторная универсальная; 4-аминоантипирин; аммиак водный; аммоний хлористый; динатриевая соль фенилфосфорной кислоты двухводная; медь (II) сернокислая 5-водная; натрия гидроокись, раствор молярной концентрации 1,0 моль/л; уголь активированный; цинк сернокислый 7-водный; эфир этиловый; вода дистиллированная. (Приготовление основного буферного раствора, субстрата, рабочего раствора субстрата, осадителя системы цинк — медь, гидроокиси натрия молярной концентрации с (NaOH) = 1,0 моль/л).

Техника определения

В пробирку помещают 3 мл продукта, добавляют 2 мл рабочего раствора субстрата, аккуратно перемешивают и нагревают в водяной бане при температуре 42±2°С в течение 30 мин. Затем в пробирку добавляют 5 мл осадителя системы цинк – медь, тщательно перемешивают содержимое пробирки и снова погружают в водяную баню температурой 42±2°С на 10 мин. Пробирку вынимают из водяной бани и проводят визуальное сравнение содержимого пробирки испытуемого продукта с контрольным опытом.

Контрольный опыт. Контрольным опытом для всех продуктов является аналогичная реакция с кипяченым молоком. Если контрольный опыт с кипяченым молоком дает слабо-розовое окрашивание, то динатриевая соль фенилфосфорной кислоты подлежит дополнительной очистке.

При отсутствии фермента фосфатазы в исследуемом продукте окраска содержимого пробирки (раствора, отделившегося от осажденного белка) будет бесцветной, т.е. аналогичной содержимому пробирок в контрольном опыте. Следовательно, молоко и молочные продукты подвергались пастеризации при температуре не ниже 63°С.

При наличии фосфатазы в исследуемом продукте содержимое пробирок (раствора) будет иметь оттенок от розового до темно-красного. Следовательно, молоко и молочные продукты не подвергались пастеризации или подвергались пастеризации при температуре ниже 63°С, или были смешаны с непастеризованным молочным продуктом.

При оценке реакции учитывается только цвет, но не прозрачность раствора. Чувствительность метода позволяет обнаружить добавление непастеризованных молочных продуктов к пастеризованным в следующих количествах: 0,3% – в молоке, сливках, кисломолочных продуктах (жидких); 0,5% – в твороге и сметане; 1% – в кисломолочных продуктах с немолочными компонентами и сыворотке.

1.2. По реакции с фенолфталеинфосфатом натрия

Сущность метода. Метод основан на гидролизе фенолфталеинфосфата натрия ферментом фосфатазой, содержащейся в молоке и молочных продуктах. Освобождающийся при гидролизе фенолфталеин в щелочной среде дает розовое окрашивание.

Оборудование, материалы и реактивы. Весы лабораторные аналитические; весы лабораторные технические; пробирки; пипетки вместимостью 2 мл; пипетки вместимостью 5 и 10 мл; капельницы из темного стекла; колбы мерные вместимостью 250 и 500 мл; колбы конические вместимостью 250 мл; баня водяная; вода дистиллированная; аммиак водный, химически чистый, раствор молярной концентрации 1,0 моль/л; аммоний хлористый, химически чистый раствор молярной концентрации 1,0 моль/л; фенолфталеинфосфат натрия, раствор массовой долей 0,1%; вода дистиллированная.

Техника определения

В пробирку отмеривают 2 мл исследуемого молока и 1 мл раствора фенолфталеинфосфата натрия и тщательно перемешивают. Пробирку с содержимым помещают на водяную баню при 42±2°C и определяют окраску содержимого пробирки через 10 мин. и 1 ч. При наличии фосфатазы содержимое пробирки приобретает окраску от светло-розовой до ярко-розовой. Отсутствие окрашивания – признак надежной пастеризации молока. Это значит, что пастеризация продолжалась не менее 30 мин. при температуре не ниже 63°C.

Сырое или пастеризованное молоко с нарушением установленных температурных режимов дает окрашивание от светлого до ярко-розового – фосфатаза остается в активном состоянии. Аналогичный результат будет и в том случае, если пастеризованное молоко содержит примесь сырого молока.

2. Определение пероксидазы

2.1. По реакции с солянокислым парафенилендиамином

Сущность метода. Метод основан на разложении перекиси водорода ферментом пероксидазы, содержащейся в молоке и молочных продуктах. Освобождающийся при разложении перекиси водорода активный кислород окисляется парафенилендиамином, образуя соединение синего цвета.

Оборудование, материалы и реактивы. Весы неавтоматического действия; часы электронно-механические; термометр лабораторный жидкостный диапазоном измерения температур от 0 до 100°С; баня водяная термостатируемая; плитка электрическая; бюретки; колбы мерные на 100 мл, 500 мл, 1 л; пипетки; капельница из темного стекла; колба коническая; пробирки, стаканы; воронка; бумага фильтровальная; штатив для пробирок; палочки стеклянные оплавленные; водорода пероксид (перекись), раствор массовой долей 0,5 %; калий марганцовокислый, молярной концентрации 0,1 моль/л; кислота лимонная, кислота серная; натрий фосфорнокислый двузамещенный; парафенилендиамин солянокислый с содержанием основного вещества не менее 99,5%, раствор массовой долей 2%; вода дистиллированная.

Подготовка проб. Кисломолочные продукты с немолочными компонентами (например, с плодово-ягодными наполнителями) фильтруют через бумажный фильтр. Продукты с отделяемыми пищевкусовыми компонентами и декорированные (орехи, печенье, вафли в виде декора, глазурь, начинки в виде стержня и другие отделяемые компоненты) максимально полно освобождают от наполнителей, глазури и  декора.  Для  получения  2–3  мл плазмы масла 50,0 г сливочного масла или масляной пасты расплавляют при температуре 50±2°С и охлаждают до температуры 15±2°С. Затем застывший слой жира удаляют, плазму фильтруют через бумажный фильтр.

Техника определения

Проводят два параллельных измерения. В пробирку помещают 5 мл молока, добавляют 2,5 мл буферной смеси и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Пробирки с содержимым помещают в водяную баню и термостатируют при температуре 35±2°С в течение 5±1 мин. Затем в пробирки добавляют 6 капель раствора перекиси водорода массовой долей 0,5% и  3 капли раствора парафенилендиамина солянокислого массовой долей 2%, перемешивая вращательными движениями пробирки после добавления каждого реактива. Пробирки помещают в водяную баню температурой 35±2°С и наблюдают изменение окраски содержимого пробирки.

При отсутствии фермента пероксидазы в молоке и молочных продуктах цвет содержимого пробирки не изменяется. Следовательно, молоко и молочные продукты подвергались пастеризации при температуре не ниже 80°С. При наличии пероксидазы в молоке, сливках, сливочном масле содержимое пробирок приобретает темно-синее окрашивание. При наличии пероксидазы в кисломолочных продуктах и кисло-сливочном масле содержимое пробирок приобретает серо-фиолетовый цвет, постепенно переходящий в темно-синее окрашивание. Следовательно, молоко и молочные продукты не подвергались пастеризации или подвергались пастеризации при температуре ниже 80°С, или были смешаны с непастеризованными продуктами. Чувствительность метода позволяет обнаружить добавление не менее 5% непастеризованных молочных продуктов к пастеризованным.

2.2. По реакции с йодистокалиевым крахмалом

Сущность метода. Метод основан на разложении перекиси водорода ферментом пероксидазой, содержащейся в молоке и молочных продуктах. Освобождающийся при разложении перекиси водорода активный кислород окисляет йодистый калий, освобождая йод, образующий с крахмалом соединение синего цвета.

Оборудование, материалы и реактивы. Водорода пероксид (перекись), раствор массовой долей 0,5%; крахмал растворимый, калий йодистый; вода дистиллированная.

Техника определения

Проводят два параллельных измерения. В пробирку помещают 5 мл молока. Добавляют 5 капель раствора йодистокалиевого крахмала и 5 капель раствора перекиси водорода массовой долей 0,5%, перемешивая вращательными движениями содержимое пробирки после добавления каждого реактива. Затем наблюдают изменение окраски содержимого пробирки.

При отсутствии фермента пероксидазы в молоке и молочных продуктах цвет содержимого пробирки не изменится. Следовательно, молоко и молочные продукты подвергались пастеризации при температуре не ниже 80°С. При наличии пероксидазы в молоке, сливках, сливочном масле содержимое пробирок приобретает темно-синее окрашивание. При наличии пероксидазы в кисломолочных продуктах и кисло-сливочном масле содержимое пробирок не более чем через 2 мин. приобретает серовато-синюю окраску, постепенно переходящую в темно-синюю. Следовательно, молоко и молочные продукты не подвергались пастеризации или подвергались пастеризации при температуре ниже 80°С, или были смешаны с непастеризованными молочными продуктами. Появление окраски в пробирках более чем через 2 мин. после добавления йодистокалиевого крахмала и перекиси водорода не указывает на отсутствие пастеризации, так как может вызываться разложением реактивов.

Чувствительность метода позволяет обнаружить добавление не менее 5% непастеризованных молочных продуктов к пастеризованным, а для кисломолочных продуктов с немолочными компонентами – 0,5%.