Качество молока. Определение наличия антибиотиков в молоке

Содержание страницы

При лечении мастита и других заболеваний животных применяют пенициллин, стрептомицин, тетрациклины и другие антибиотики. Принято считать, что антибиотики переходят в молоко в течение 48–72 ч. после введения их в молочную железу.

Присутствие антибиотиков в молоке изменяет его свойства. Такое молоко при употреблении его в пищу может вызвать аллергические реакции у людей с повышенной чувствительностью к антибиотикам. Содержание в молоке антибиотиков, даже в небольших концентрациях, подавляет развитие молочнокислых бактерий, применяемых при производстве кисломолочных продуктов. Наиболее чувствительны к антибиотикам термофильный стрептококк и молочнокислые палочки. Антибиотики нарушают сычужное свертывание молока при производстве творога и сыра, что приводит к ухудшению качества этих продуктов.

ГОСТ Р 52054 устанавливает следующие методы определения содержания антибиотиков в сыром молоке: микробиологический, иммунологический, высокоэффективной газовой хроматографии и инструментальный.

1. Микробиологические методы определения наличия антибиотиков

ГОСТ 31502 устанавливает в сыром, пастеризованном, стерилизованном и предварительно восстановленном сухом коровьем молоке качественные микробиологические методы определения наличия антибиотиков:

  • чашечный метод с Bacillus stearothermophilus;
  • метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бромкрезолпурпур;
  • метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бриллиантовый черный.

Оборудование, материалы и реактивы. Весы лабораторные с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания ±0,0002 г; холодильник бытовой; центрифуга с частотой вращения 3000 мин-1 и разделяющим фактором 750 м/с2; пробирки центрифужные термостойкие вместимостью 25 мл; термостат или блок термостатированных ячеек, поддерживающий температуру от 30 до 70°С с допустимой погрешностью ±0,5°С; баня водяная с терморегулятором, поддерживающая температуру от 60 до 90°С; анализатор потенциометрический диапазоном измерений от 5,5 до 8,0 ед. рН; сепаратор-сливкоотделитель; шкаф сушильный, поддерживающий температуру 160±5°С; автоклав, поддерживающий температуру 121±2°С; стерилизатор воздушный медицинский или стерилизатор паровой медицинский, поддер-живающий температуру 121±2°С; электроплитка бытовая; микроскоп световой биологический; пробойник диаметром 10 мм или сверло пробочное № 4; часы механические с сигнальным устройством; линейка с пределом измерения 150 мм; аппарат «Микрофот 5ПО-1» или другой проекционный аппарат; колбы конические 25, 100, 250 мл; колбы мерные вместимостью 200 и 1000 мл; пробирки вместимостью 10 мл; чашка Петри; пипетки градуированные вместимостью 5, 10 и 25 мл; пипетки, отмеряющие объем 0,05 и 0,1 мл; шприц-дозатор автоматический вместимостью 0,1 мл или шприц-дозатор автоматический вместимостью 1,0 мл, настроенный на объем пробы 0,1 мл; наконечники пластмассовые одноразовые вместимостью 0,1 мл; пинцет; гидролизат кормовых дрожжей; эталон стандартный мутности; препарат сухой для контроля определения ингибирующих веществ в молоке (СКИВ); образец стандартный стрептомицина; фуксин основной для микробиологических целей, спиртовой раствор массовой концентрации 0,05 г/мл; экстракт дрожжевой; глюкоза; пептон сухой ферментированный для бактериологических целей; агар микробиологический; натрий хлористый; калий фосфорнокислый однозамещенный; калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный; калия гидрат окиси, раствор массовой концентрации 0,056 г/мл; кислота соляная, раствор массовой концентрации 0,0365 г/мл; вода дистиллированная.

Тест-наборы для определения наличия антибиотиков:

Тест-культура № 11) – тест-культура Bacillus stearothermophilus.

1) Тест-культура Bacillus stearothermophilus var. calidolactis ВКМБ-510, выпускаемая Институтом биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН.

Тест-набор № 1, включающий: пластины из герметично укупоренных ампул, содержащих смесь агаровой и питательной сред, споры Bacillus stearothermophilus var. calidolactis и индикатор бромкрезолпурпур; клейкую ленту (для пластин).

Тест-набор № 22), включающий: герметично укупоренные фольгой и содержащие смесь агаровой и питательной сред со спорами Bacillus stearothermophilus var. calidolactis и индикатором бромкрезолпурпур, пластины микропробирок или собранные рамкой в блоки ампулы вместимостью 1,0 мл; одноразовые пипетки вместимостью 0,1 мл, клейкую ленту (для пластин).

2) Тест-наборы «Delvotest SP-NT», «Delvotest SP MINI-NT».

Тест-набор № 33), по составу сходен с Тест-набором № 22),

3) Тест-набор «Delvotest T».

Тест-набор № 44), по составу сходен с Тест-набором № 22),

4) Тест-набор «Delvotest T-ST».

Тест-набор № 55), включающий: пластины герметично укупоренных фольгой микропробирок, содержащих смесь агаровой и питательной сред со спорами Bacillus stearothermophilus var. calidolactis и индикатором бромкрезолпурпур; одноразовые пипетки вместимостью 0,1 мл; клейкую ленту (для пластин).

5)Тест-набор «Delvotest T-ST-DA».

Тест-набор № 6, включающий герметично укупоренные пробирки, полоски или пластины со смесью агаровой и питательной сред, содержащей споры Bacillus stearothermophilus var. calidolactis и индикатор бриллиантовый черный; самоклеящуюся ленту для пластин; контрольный раствор молока с пенициллином G массовой концентрацией 0,004 мкг/г и контрольный раствор молока без антибиотиков.

Отбор и подготовка проб – по ГОСТ ISO 707, ГОСТ 3622, ГОСТ 26668, ГОСТ 26669, ГОСТ 26809 с дополнением. Допускается хранить подготовленные пробы молока в холодильнике при температуре 5±1°С не более 24 ч.

2. Методы контроля

2.1. Чашечный метод с Bacillus stearothermophilus

Метод основан на способности антибиотиков, содержащихся в молоке, диффундировать в агаровую среду со спорами Bacillus stearothermophilus и препятствовать их росту, что приводит к образованию прозрачных зон ингибиции. Наличие антибиотиков в молоке устанавливают по размеру диаметра зоны ингибиции. Подготовка лабораторной посуды – по ГОСТ ISO 7218.

Техника определения

На поверхности агаровой среды, разлитой в чашки Петри, пробойником или пробочным сверлом вырезают семь лунок диаметром 10 мм (рис. 8). Шесть лунок располагают по окружности чашки на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 28 мм их центров от центра чашки. Седьмую лунку вырезают в центре чашки в случае использования контрольного раствора стрептомицина.

Схема расположения лунок

Рис. 1. Схема расположения лунок

В шесть лунок, расположенных по окружности чашки, пипеткой вносят по 0,05 мл анализируемого молока, подготовленного. В центральную лунку вносят 0,05 мл контрольного раствора стрептомицина. Чашки Петри выдерживают при комнатной температуре в течение 20 мин., затем их помещают в термостат крышками вверх и инкубируют при температуре 55±1°С в течение 4 ч. Чашки в термостате размещают в один ряд.

Обработка результатов. Результаты определения оценивают непосредственно после инкубирования, просматривая чашки Петри в проходящем свете от любого источника света. Диаметры зон ингибиции роста тест-культуры, образуемых при взаимодействии с антибиотиками в пробах анализируемого молока и контрольным раствором стрептомицина, измеряют линейкой или на аппарате «Микрофот 5ПО-1» по краям окружностей зон. При отсутствии зон ингибиции контрольного раствора стрептомицина (центральная лунка) определение повторяют. Зона ингибиции диаметром 12 мм и более свидетельствует о присутствии антибиотиков в анализируемой пробе молока. Зона ингибиции диаметром не более 12 мм или ее отсутствие свидетельствует об отсутствии антибиотиков в анализируемой пробе.

2.2. Метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бромкрезолпурпур

Метод основан на изменении окраски агаровой среды со спорами Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C953 от фиолетовой до желтой – при отсутствии в анализируемом молоке антибиотиков и сохранении фиолетовой окраски – при наличии антибиотиков.

Подготовка к определению. Термостат или водяную баню нагревают до температуры 64±1°С. Подготовка тест-набора № 1. Необходимое количество ампул отрезают от пластины, маркируют их и выдерживают при температуре 20±2°С. Оставшиеся ампулы в упаковке хранят в холодильнике при температуре 6±2°С с учетом срока годности. Открывают ампулы, проколов фольгу с помощью шприца или ножниц. Подготовка тест-наборов № 2, № 3, № 4 и № 5. При использовании тест-наборов с пластинами микропробирок необходимое количество микропробирок отрезают от пластины ножницами или ножом и выдерживают при температуре 20±2°С.

Открывают микропробирки, полностью удаляя фольгу, и маркируют их. Оставшиеся пластины в упаковке хранят в холодильнике при температуре 6±2°С с учетом срока годности. При использовании тест-наборов с блоками ампул необходимое количество ампул достают из рамки, маркируют и выдерживают при температуре 20±2°С. Открывают ампулы, проколов фольгу с помощью острого угла рамки или ножниц. Оставшиеся ампулы в упаковке хранят в холодильнике при температуре 6±2°С с учетом срока годности.

Техника определения

Проведение определения с использованием тест-набора № 1. В каждую ампулу пипеткой вносят 0,1 мл анализируемого молока, используя каждый раз новую пипетку. Оставшиеся анализируемые пробы хранят в холодильнике при температуре 6±2°С до окончания определения. Ампулы заклеивают клейкой лентой, помещают в термостат или на водяную баню и выдерживают при температуре 65±2°С в течение 3 ч. Проведение определения с использованием тест-наборов № 2, № 3, № 4 и № 5.

При использовании тест-наборов с пластинами микропробирок в каждую микропробирку пипеткой вносят 0,1 мл анализируемого молока, используя каждый раз новую пипетку. После отбора пробы пипеткой избыток молока попадает в специальный резервуар на пипетке. Если этого не произошло – отбор пробы молока повторяют. Оставшиеся анализируемые пробы хранят в холодильнике при температуре 6±2°С до окончания определения. Пластину с микропробирками заклеивают клейкой лентой, помещают в термостат или на водяную баню и выдерживают при температуре 64±2°С в течение 3 ч. (при использовании тест-набора № 4 – 4 ч). При использовании тест-наборов с блоками ампул в каждую ампулу пипеткой вносят 0,1 мл анализируемого молока, используя каждый раз новую пипетку.

После отбора пробы пипеткой избыток молока попадает в специальный резервуар на пипетке. Если этого не произошло – отбор пробы молока повторяют. Оставшиеся анализируемые пробы хранят в холодильнике при температуре 6±2°С до окончания определения. Ампулы помещают в термостат или на водяную баню и выдерживают при температуре 64±2°С в течение 3 ч. (при использовании тест-набора № 4-4 ч.). При проведении контрольного определения в ампулу (микропробирку) вносят 0,1 мл предварительно восстановленного по ГОСТ 23454 препарата СКИВ.

Обработка результатов. Ампулы (пластины с микропробирками) извлекают из термостата или водяной бани и определяют цвет их содержимого. Желтый цвет содержимого ампул (микропробирок) с анализируемыми пробами молока свидетельствует об отсутствии в нем антибиотиков. Фиолетовое кольцо, образовавшееся на поверхности содержимого ампул (микропробирок) (диаметром не более 1 мм), не учитывают. Фиолетовый цвет содержимого ампул (микропробирок) с анализируемыми пробами молока указывают на наличие антибиотиков.

2.3. Метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бриллиантовый черный

Метод основан на изменении окраски агаровой среды со спорами Bacillus stearothermophilus var. calidolactis от синей до желтой – при отсутствии в анализируемом молоке антибиотиков и других ингибирующих веществ и сохранении синей окраски – при наличии антибиотиков.

Подготовка к определению. Отрезают необходимое число полосок от тестовых пластин тест-набора № 6 или берут требуемое количество пластин или пробирок тест-набора № 1. Удаляют запаянную фольгу с тестовых полосок и пластин или откупоривают пробирки. Оставшиеся пластины или пробирки хранят в холодильнике при температуре 5±1°С.

Техника определения

При использовании пластин или полосок в одну из ячеек каждой пластины или полоски одноразовой пипеткой вносят 0,1 мл контрольного раствора молока без антибиотиков, в другую ячейку – 0,1 мл контрольного раствора молока с пенициллином G, в остальные ячейки пластины или полоски вносят по 0,1 мл анализируемого молока в двукратной повторности.

При использовании пробирок в одну пробирку одноразовой пипеткой вносят 0,1 мл контрольного раствора молока без антибиотиков, в другую — 0,1 мл контрольного раствора молока с пенициллином G, в остальные пробирки одноразовой пипеткой вносят по 0,1 мл анализируемого молока в двукратной повторности. Тестовые пластины и полоски заклеивают самоклеящейся лентой, пробирки закупоривают и помещают в блок термостатированных ячеек или на водяную баню при температуре 65,0±0,5°С и выдерживают до тех пор, пока содержимое на дне ячейки тестовых пластин или полосок, или пробирки с контрольным раствором молока без антибиотиков не окрасится полностью в желтый цвет в течение 135±15 мин.

Обработка результатов. Пробирки, тестовые пластины или тестовые полоски извлекают из блока термостатируемых ячеек или водяной бани и определяют цвет содержимого на дне, не нарушая их целостности. Желтый цвет содержимого пробирок или ячеек тестовых полосок, или пластин с контрольным раствором и анализируемыми пробами молока свидетельствует об отсутствии в нем антибиотиков. Синий цвет содержимого пробирок или ячеек тестовых полосок, или пластин с контрольным раствором и анализируемыми пробами молока указывает на наличие в нем антибиотиков.

Метрологические характеристики

Наименьшие пределы определения антибиотиков в молоке приведены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1. Наименьшие пределы определения антибиотиков в молоке (Тест-наборы 1−3) мг/л (кг)

Наименование

антибиотика

Наименьший предел определения
Чашечный метод

с Bacillus

stearothermophilus

Метод с Bacillus stearothermophilus

и индикатором

бромкрезолпурпур

Метод с Bacillus

stearothermophilus

и индикатором

бриллиантовый

черный

Тестнабор

№ 1

Тестнабор

№ 2

Тестнабор

№ 3

Амоксициллин 0,002 0,003 0,004 0,002
Ампициллин 0,002 0,003 0,004 0,002
Бацитрацин 0,58 1,5
Бензилпенициллин 0,005 0,002
Гентамицин 0,025 0,065 0,2
Данофлоксацин 0,8
Дапсон 0,03
Дигидрострептомицин 0,7 0,2 0,8 1,0
Диклоксациллин 0,006 0,01 0,01
Канамицин 0,15 1,01
Клоксациллин 0,012 0,015 0,006 0,02
Линкомицин 0,17 0,12 0,15
Марбофлоксацин 0,8
Мономицин 0,25
Нафциллин 0,004 0,005 0,01
Неомицин 0,25 0,115 0,05 0,06 0,5
Новобиоцин 0,75
Оксациллин 0,01 0,03 0,01
Окситетрациклин 0,1 0,3 0,1 0,1 0,5
Олеандомицин 2,5
Пенициллин G 0,002 0,002 0,002
Пиперациллин 0,01
Рифаксимин 0,05
Рифампицин 0,1 0,04
Спирамицин 0,28 0,6 0,4
Спектиномицин 0,2 2,01
Стрептомицин 0,5 0,95 0,4 0,4
Сульфадиазин 0,065 0,025 0,04 0,5
Сульфадиметоксин 0,025 0,04 0,5
Сульфадоксин 0,13
Сульфакиноксалин 0,025
Сульфамеразин 0,025
Сульфаметазин 0,1 0,135 0,5
Сульфаметоксазол 0,025
Сульфатиазол 0,04 0,04 0,2
Тетрациклин 0,1 0,32 0,1 0,07 0,2
Тилмикозин 0,06
Тилозин 0,035 0,04 0,035 0,025
Триметоприм 0,1 0,11
Хлорамфеникол (левомицетин) 2,5 2,5 4,1 5,0
Хлортетрациклин 0,05 0,1 0,15
Цефазолин 0,01
Цефалексин 0,045 0,03 0,2
Цефалониум 0,006 0,01
Цефапирин 0,006 0,004
Цефкином 0,065 0,04 0,1
Цефоперазон 0,03 0,04 0,025
Цефтиофур 0,02 0,05
Цефуроксим 0,2
Эритромицин 0,05 0,09 0,1 0,16 0,04

Таблица 2. Наименьшие пределы определения антибиотиков в молоке (Тест-наборы 4–5) мг/л (кг)

Наименование

группы антибиотиков

Наименьший предел определения
Метод с Bacillus

stearothermophilus

и индикатором

бромкрезолпурпур

Тест-набор № 4 Тест-набор № 5
ампулы планшеты

микропробирок

Пенициллин 0,004 0,004
Тетрациклиновая

группа

0,07 0,075 0,05
Стрептомицин 0,2 0,2
Хлорамфеникол

(левомицетин)

4,1 3,08 3,08

2.4. Иммунологические методы определения наличия антибиотиков (ГОСТ 32219)

Настоящий стандарт распространяется на сырое, пастеризованное, стерилизованное и предварительно восстановленное сухое молоко и сыворотку, в т.ч. сухую, и устанавливает качественные иммуноферментные методы определения наличия антибиотиков:

  • методы определения наличия антибиотиков бета-лактамного типа;
  • методы одновременного определения наличия антибиотиков бета-лактамного типа и тетрациклиновой группы;
  • метод одновременного определения наличия левомицетина (хлорамфеникола) и стрептомицина;
  • методы одновременного определения наличия антибиотиков бета-лактамного типа, тетрациклиновой группы, левомицетина и стрептомицина.

Оборудование, материалы и реактивы. Термостат, позволяющий поддерживать температуру от 37 до 66°С с допустимой погрешностью ±0,5°С; баня водяная с терморегулятором, поддерживающая температуру от 37 до 66°С с отклонением от заданной температуры ±1°С; холодильник бытовой; камера морозильная, позволяющая поддерживать температуру минус (20±2)°С; часы механические с сигнальным устройством; термометр лабораторный стеклянный с диапазоном измерения от 0 до 100°С, ценой деления шкалы 1°С; пипетки вместимостью 0,5 и 1,0 мл; вода дистиллированная; бумага фильтровальная.

Тест-наборы для определения наличия антибиотиков:

Тест-набор №11) для определения антибиотиков беталактамного типа, включающий закрытые крышкой пробирки с 3,3‘, 5,5′-тетраметилбензидином и специфическими рецепторами; пипетки вместимостью 0,45 мл; индикаторное устройство с диметилсульфоксидом;

1) Тест-набор «СНАП Бета-Лактам СТ» (IDEXX, США).

Тест-набор № 2 для определения антибиотиков беталактамного типа, включающий флаконы с лиофилизатом, индикаторные полоски хроматографической бумаги, пипетки вместимостью 0,15 мл;

2)Тест-набор «Delvotest BLF» (DSM Food Specialties B.V., Нидерланды).

Тест-набор № 3 для одновременного определения антибиотиков бета-лактамного типа и тетрациклиновой группы, включающий пеналы с пластинами микропробирок со специфическими белковыми рецепторами, меченными коллоидным золотом; индикаторными полосками хроматографической бумаги; пипетками вместимостью 0,2 мл с наконечниками; контрольные растворы: пробирки или флаконы со смесью сухого молока с массовой концентрацией пенициллина-G 0,004 мкг/г и окситетрациклина 0,01 мкг/г, красителя («Positive Standard»); пробирки и флаконы со смесью сухого молока без антибиотиков и красителя («Negative Standard»);

3)Тест-набор «TwinsensorВТ» (Unisensor, Бельгия).

Тест-набор № 41) для одновременного определения антибиотиков бета-лактамного типа и тетрациклиновой группы в соответствии с требованиями, предъявляемыми к тест-набору № 1;

1)Тест-набор «СНАП Дуо Бета-Тетра СТ» (IDEXX, США).

Тест-набор № 52) для одновременного определения антибиотиков бета-лактамного типа и тетрациклиновой группы, включающий закрытые крышкой флаконы со специфическими рецепторами, меченными коллоидным золотом; индикаторные полоски хроматографической бумаги; пипетку вместимостью 0,2 мл с наконечниками;

2)Тест-набор «Betastar Combo» (Neogen Corporation, США).

Тест-набор № 63) для одновременного определения левомицетина и стрептомицина, включающий флаконы; индикаторные полоски хроматографической бумаги; пипетки вместимостью 0,2 или 0,3 мл;

2) Тест-набор «Reveal for CAP/STREP» (Neogen Corporation, США).

Тест-набор № 74) для одновременного определения антибиотиков бета-лактамного типа, тетрациклиновой группы, левомицетина и стрептомицина, включающий пеналы с пластинами микропробирок со специфическими белковыми рецепторами, меченными коллоидным золотом; индикаторные полоски хроматографической бумаги; пипетки вместимостью 0,2 мл с наконечниками; контрольные растворы: пробирки или флаконы со смесью сухого молока с концентрацией пенициллина-G 0,004 мг/кг; окситетрациклина 0,01 мг/кг, стрептомицина 0,2 мг/кг, хлорамфеникола 0,0003 мг/кг и красителя («Positive Standard»); пробирки и флаконы со смесью сухого молока без антибиотиков и красителя («Negative Standard»);

4)Тест-набор «4sensorВТSC» (Unisensor, Бельгия).

Тест-набор № 85) для одновременного определения антибиотиков бета-лактамного типа, тетрациклиновой группы, левомицетина и стрептомицина в соответствии с требованиями, предъявляемыми к тест-набору № 6;

5) Тест-набор «Betastar 4D» (Neogen Corporation, США).

Тест-набор № 96) для одновременного определения наличия антибиотиков бета-лактамного типа и тетрациклиновой группы,

включающий пластину микропробирок со специфическими рецепторами, меченными коллоидным золотом; индикаторные полоски хроматографической бумаги; пипетку вместимостью 0,2 мл с наконечниками (дополнительно);

6)Тест-набор «PROQUI-TEST R 10 ppb» (Proquiga Biotech, SA, Испания).

Тест-набор № 107) для одновременного определения наличия антибиотиков бета-лактамного типа, тетрациклиновой группы, левомицетина и стрептомицина, включающий пеналы с пластинами микропробирок со специфическими рецепторами, меченными коллоидным золотом; индикаторные полоски хроматографической бумаги; пипетку вместимостью 0,2 мл с наконечниками (дополнительно).

7) Тест-набор «PROQUI-TEST 4» (Proquiga Biotech, SA, Испания).

Буфер для восстановления сухой сыворотки Unisensor Dilution Buffer (Unisensor, Бельгия); раствор гидроксида натрия молярной концентрации с (NaOH) = 1 моль/л; анализатор потенциометрический, с диапазоном измерений от 5,5 до 8,0 ед. рН с погрешностью ±0,05 ед. рН; криостат, позволяющий поддерживать температуру 4±2 и 6±2°С; дозаторы автоматические или механические одноканальные или многоканальные переменной вместимости 0,01-0,1 и 0,1-1 мл, с допускаемым относительным СКО не более 8,0%; часы 2-го класса точности.

3. Методы определения наличия антибиотиков

3.1. Методы определения наличия антибиотиков бета-лактамного типа

Метод с использованием тест-набора № 1. Метод основан на иммуноферментной реакции, в процессе которой антибиотики бета-лактамного типа захватываются специфическими белковыми рецепторами, меченными ферментом с индикатором, с образованием химически прочного комплекса, блокирующего свойство индикатора изменять цвет продуктов химических реакций. Наличие антибиотиков устанавливают визуально, сравнивая интенсивность цвета зоны определения антибиотиков с интенсивностью цвета контрольной зоны индикаторного устройства.

Подготовка к определению. Тест-набор № 1 хранят в холодильнике при температуре от 2 до 8°С. Перед началом работы необходимое количество тест-наборов выдерживают при температуре от 15 до 30°С в течение 5 мин. Анализируемое молоко хранят в холодильнике при температуре от 0 до 10°С. Вскрывают упаковку тест-набора и проверяют положение шарика реактива в пробирке, который должен находиться на дне. При необходимости шарик реактива устанавливают на дно пробирки встряхиванием.

Техника определения

Снимают крышку с пробирки. Пипетку вместимостью 0,45 мл наполняют анализируемым молоком до метки и выливают в пробирку. Пробирку закрывают крышкой и перемешивают круговыми движениями до растворения реактива. Индикаторное устройство устанавливают на горизонтальной поверхности так, чтобы приемная воронка для заливания анализируемой смеси находилась слева от оператора. Содержимое пробирки переливают в приемную воронку индикаторного устройства. В момент начала изменения цвета активационного окна клавишу индикаторного устройства нажимают до щелчка. Через 6 мин. считывают результат. Стабильность окраски сохраняется в течение 30 мин.

Обработка результатов. Сравнивают интенсивность окрашенных в синий цвет зон в окнах индикаторного устройства (рис. 2).

определение наличия антибиотиков с использованием тест-набора

Рис. 2. Примеры результатов определения наличия антибиотиков с использованием тест-набора № 1: 1, 2 – антибиотики отсутствуют; 3 – антибиотики присутствуют

Если после проведения определения изменения цвета контрольной зоны не произошло, то определение наличия антибиотиков в молоке повторяют с новым тест-набором. Большая или равная интенсивность цвета зоны определения антибиотиков по сравнению с интенсивностью цвета контрольной зоны свидетельствует об отсутствии антибиотиков в анализируемом молоке.

Меньшая интенсивность цвета зоны определения антибиотиков по сравнению с интенсивностью цвета контрольной зоны, а также отсутствие ее окрашивания указывают на наличие антибиотиков в анализируемом молоке.

Метод с использованием тест-набора № 2. Метод основан на реакции комплексообразования антибиотиков беталактамного типа с белковыми рецепторами, содержащимися в лиофилизате, и последующем визуальном выявлении оставшихся свободными рецепторов путем хроматографии на индикаторных полосках хроматографической бумаги, содержащих в виде соответствующих линий реакционную и контрольную зоны.

Подготовка к определению. Тест-набор № 2 хранят в холодильнике при температуре 6±2°С не более 9 мес. Перед началом работы необходимое количество флаконов извлекают из тестнабора, выдерживают при температуре от 15 до 30°С, после чего открывают, удаляя фольгу. Термостат или водяную баню нагревают до температуры 64±2°С.

Техника определения

Пипетку вместимостью 0,15 мл наполняют анализируемым молоком, выливают во флакон и перемешивают круговыми движениями. Флакон помещают в термостат или на водяную баню и выдерживают при температуре 64±2°С в течение 2 мин. После этого флакон достают из термостата (водяной бани), перемешивают круговыми движениями до растворения реактива и помещают обратно. В флакон, находящийся в термостате (на водяной бане), помещают индикаторную полоску хроматографической бумаги и выдерживают в течение 3 мин. По истечении времени индикаторную полоску хроматографической бумаги извлекают из флакона и считывают результат.

Сравнивают интенсивность окрашенных в красный цвет зон, появившихся на индикаторной полоске хроматографической бумаги в виде линий (рис. 3).

определение наличия антибиотиков

Рис. 3. Примеры результатов определения наличия антибиотиков с использованием тест-набора № 21 – антибиотики отсутствуют; 2, 3, 4 – антибиотики присутствуют; 5 – недействительный результат

Зона в верхней части индикаторной полоски хроматографической бумаги является контрольной. Если после проведения определения окрашивания контрольной зоны не произошло, то определение наличия антибиотиков в молоке повторяют с новым тест-набором. Зона определения антибиотиков на индикаторной полоске хроматографической бумаги расположена под контрольной. Большая интенсивность цвета зоны определения антибиотиков по сравнению с интенсивностью цвета контрольной зоны свидетельствует об отсутствии антибиотиков в анализируемом молоке. Меньшая или равная интенсивность цвета зоны определения антибиотиков по сравнению с интенсивностью цвета контрольной зоны, а также отсутствие ее окрашивания указывают на наличие антибиотиков в анализируемом молоке.

3.2. Методы одновременного определения наличия антибиотиков бета-лактамного типа и тетрациклиновой группы

Метод с использованием тест-набора № 3. Метод основан на реакции комплексообразования антибиотиков бета-лактамного типа и тетрациклиновой группы со специфическими белковыми рецепторами, меченными коллоидным золотом, и последующем визуальном выявлении оставшихся свободными меченых рецепторов путем хроматографии на индикаторных полосках хроматографической бумаги, содержащих в виде соответствующих линий реакционные и контрольную зоны. Метод распространяется на молоко и сыворотку, в том числе сухую.

Подготовка к определению. Тест-набор № 3 хранят в холодильнике при температуре от 2 до 8°С не более 12 мес. Перед началом работы необходимое количество пеналов из тест-набора выдерживают при температуре от 15 до 30°С. Термостат или водяную баню нагревают до температуры 40±3°С и выдерживают при этой температуре не менее 5 мин. Восстановление контрольных растворов «Positive Standard» и «Negative Standard». В стеклянные пробирки с контрольными растворами пипеткой вносят по 1 мл дистиллированной воды (0,4 мл для контрольных растворов в пластиковых флаконах) и перемешивают до образования однородного раствора. Срок хранения восстановленных контрольных растворов в морозильной камере при температуре минус 20°С – не более 6 мес. Не допускается повторное замораживание восстановленных контрольных растворов.

Техника определения

Микропробирки извлекают из пенала и помещают в термостат или на водяную баню с температурой 40±3°С. В каждую микропробирку пипеткой с наконечником вносят 0,2 мл анализируемого молока, перемешивают, наполняя и сливая содержимое с помощью пипетки пять раз для получения однородного раствора, и выдерживают в термостате (на водяной бане) в течение 3 мин. Для каждой микролунки используют новый наконечник на пипетку. Индикаторные полоски хроматографической бумаги извлекают из пенала, помещают в микропробирки и выдерживают в термостате (на водяной бане) при температуре 40±3°С в течение 3 мин. По истечении времени индикаторные полоски хроматографической бумаги извлекают из микропробирок и считывают результат способом, рекомендуемым изготовителем тест-набора. Определение с использованием контрольных

растворов проводят, как указано выше, при этом в одну микропробирку пипеткой с наконечником вносят 0,2 мл раствора «Positive Standard», в другую – 0,2 мл раствора «Negative Standard».

Сравнивают интенсивность цвета окрашенных в красный цвет зон, появившихся на индикаторной полоске хроматографической бумаги в виде линий (рис. 4).

определение наличия антибиотиков

Рис. 4. Примеры результатов определения наличия антибиотиков с использованием тест-набора № 3: 1 – антибиотики отсутствуют; 2 – присутствуют антибиотики бета-лактамного типа; 3 – присутствуют антибиотики тетрациклиновой группы; 4 – присутствуют антибиотики беталактамного типа и тетрациклиновой группы; 5 – недействительный результат

Зона центральной части индикаторной полоски хроматографической бумаги является контрольной. Если после проведения определения окрашивания контрольной зоны не произошло, то определение наличия антибиотиков в продукте повторяют с новым тест-набором. Зона определения антибиотиков тетрациклиновой группы на индикаторной полоске хроматографической бумаги расположена над контрольной зоной. Зона определения антибиотиков бета-лактамного типа – под контрольной зоной.

Большая интенсивность цвета зон определения антибиотиков по сравнению с интенсивностью цвета контрольной зоны свидетельствует об отсутствии антибиотиков в анализируемом продукте. Меньшая или равная интенсивность цвета зон определения антибиотиков по сравнению с интенсивностью цвета контрольной зоны, а также отсутствие их окрашивания указывает на наличие антибиотиков в анализируемом продукте. При проведении определений с применением контрольных растворов «Positive Standard» и «Negative Standard» обработку результатов проводят, как указано выше.

Метод с использованием тест-набора № 4. Метод основан на иммуноферментной реакции, в процессе которой антибиотики бета-лактамного типа и тетрациклиновой группы захватываются специфическими белковыми рецепторами, меченными ферментом с индикатором, с образованием химически прочного комплекса, блокирующего свойство индикатора изменять цвет продуктов химических реакций. Наличие антибиотиков устанавливают визуально, сравнивая интенсивность цвета зон определения антибиотиков с интенсивностью цвета контрольной зоны индикаторного устройства.

Обработка результатов. Сравнивают интенсивность окрашенных в синий цвет зон в окнах индикаторного устройства (рис. 5).

определение наличия антибиотиков

Рис. 5. Примеры результатов определения наличия антибиотиков с использованием тест-набора № 41 – антибиотики отсутствуют; 2 – присутствуют антибиотики бета-лактамного типа и тетрациклиновой группы; 3 – присутствуют антибиотики бета-лактамного типа; 4 – присутствуют антибиотики тетрациклиновой группы

Если после проведения определения изменения цвета контрольной зоны не произошло, то определение наличия антибиотиков в молоке повторяют с новым тест-набором. Большая или равная интенсивность цвета зон определения антибиотиков по сравнению с интенсивностью цвета контрольной зоны свидетельствует об отсутствии антибиотиков в анализируемом молоке. Меньшая интенсивность цвета зон определения антибиотиков по сравнению с интенсивностью цвета контрольной зоны, а также отсутствие их окрашивания указывают на наличие антибиотиков в анализируемом молоке.

Метод с использованием тест-набора № 5. Метод основан на реакции комплексообразования антибиотиков бета-лактамного типа и тетрациклиновой группы со специфическими белковыми рецепторами, меченными коллоидным золотом, и последующем визуальном выявлении оставшихся свободными меченых рецепторов путем хроматографии на индикаторных полосках хроматографической бумаги, содержащих в виде соответствующих линий реакционные и контрольную зоны.

Подготовка к определению. Тест-набор № 5 хранят в холодильнике при температуре от 2 до 8°С не более 12 мес. Перед началом работы необходимое количество тест-наборов выдерживают при температуре от 15 до 30°С в течение 10 мин. Термостат или водяную баню нагревают до температуры 37,5±1,0°С. Флаконы с реагентом встряхивают для осаждения содержимого на дне.

Техника определения

Снимают крышку с флакона. Пипеткой с наконечником вносят 0,2 мл анализируемого молока в флакон, закрывают его крышкой, встряхивают до растворения реактива и снимают крышку. Для каждого флакона используют новый наконечник на пипетку. Флакон помещают в термостат или на водяную баню и выдерживают при температуре 37,5±1,0°С в течение 5 мин. Затем в флакон, находящийся в термостате (на водяной бане), помещают индикаторную полоску хроматографической бумаги и выдерживают 3 мин. По истечении времени индикаторную полоску хроматографической бумаги извлекают из флакона и считывают результат.

Сравнивают интенсивность цвета окрашенных в красный цвет зон, появившихся на индикаторной полоске хроматографической бумаги в виде линий (рис. 6).

Зона центральной части индикаторной полоски хроматографической бумаги является контрольной. Если после проведения определения окрашивания контрольной зоны не произошло, то определение наличия антибиотиков в молоке повторяют с новым тест-набором.

определение наличия антибиотиков

Рис. 6. Примеры результатов определения наличия антибиотиков с использованием тест-набора № 51 – антибиотики отсутствуют; 2 – присутствуют антибиотики бета-лактамного типа; 3 – присутствуют антибиотики тетрациклиновой группы; 4 – присутствуют антибиотики беталактамного типа и тетрациклиновой группы; 5 – недействительный результат

Зона определения антибиотиков бета-лактамного типа на индикаторной полоске хроматографической бумаги расположена над контрольной зоной. Зона определения антибиотиков тетрациклиновой группы – под контрольной зоной. Большая интенсивность цвета зон определения антибиотиков по сравнению с интенсивностью цвета контрольной зоны свидетельствует об отсутствии антибиотиков в анализируемом молоке. Меньшая или равная интенсивность цвета зон определения антибиотиков по сравнению с интенсивностью цвета контрольной зоны, а также отсутствие их окрашивания указывают на наличие антибиотиков в анализируемом молоке.

Метод с использованием тест-набора № 9. Метод основан на реакции комплексообразования антибиотиков бета-лактамного типа и тетрациклиновой группы со специфическими белковыми рецепторами, меченными коллоидным золотом, и последующем визуальном выявлении оставшихся свободными меченых рецепторов путем хроматографии на индикаторных полосках хроматографической бумаги, содержащих в виде соответствующих линий реакционные и контрольную зоны.

Подготовка к определению. Тест-набор № 9 хранят в холодильнике при температуре 6±2°С не более 12 мес. с даты производства. Перед началом работы необходимое количество микропробирок извлекают из тест-набора.

Проведение определения. Пипетку вместимостью 0,2 мл наполняют анализируемым молоком, выливают в микропробирку и перемешивают с ее содержимым, наполняя и сливая его с помощью пипетки пять раз, до образования розового цвета. Индикаторную полоску хроматографической бумаги помещают в микропробирку на 5–10 с, затем извлекают и кладут на чистую сухую поверхность. По истечении 5–7 мин. считывают результат.

Обработка результатов. Сравнивают интенсивность цвета окрашенных в красный цвет зон, появившихся на индикаторной полоске хроматографической бумаги в виде линий (рис. 7).

определение наличия антибиотиков

Рис. 7. Примеры результатов определения наличия антибиотиков с использованием тест-набора № 9: 1 – антибиотики отсутствуют; 2 – присутствуют антибиотики бета-лактамного типа; 3 – присутствуют антибиотики тетрациклиновой группы; 4 – присутствуют антибиотики бета-лактамного типа и тетрациклиновой группы; 5 – недействительный результат

Зона верхней части индикаторной полоски хроматографической бумаги является контрольной. Если после проведения определения окрашивания контрольной зоны не произошло, то определение наличия антибиотиков в молоке повторяют с новым тест-набором. Зона определения антибиотиков тетрациклиновой группы на индикаторной полоске хроматографической бумаги расположена под контрольной зоной первой. Зона определения антибиотиков бета-лактамного типа – под контрольной зоной второй.

Большая интенсивность цвета зон определения антибиотиков по сравнению с интенсивностью цвета контрольной зоны свидетельствует о том, что концентрация определяемых антибиотиков в анализируемом молоке менее предела обнаружения. Меньшая или равная интенсивность цвета зон определения антибиотиков по сравнению с интенсивностью цвета контрольной зоны, а также отсутствие их окрашивания свидетельствуют о том, что концентрация определяемых антибиотиков в анализируемом молоке больше или равна пределу обнаружения.

Метод одновременного определения наличия левомицетина и стрептомицина с использованием тест-набора № 6. Метод основан на реакции комплексообразования левомицетина и стрептомицина со специфическими белковыми рецепторами, меченными коллоидным золотом, и последующем визуальном выявлении оставшихся свободными меченых рецепторов путем хроматографии на индикаторных полосках хроматографической бумаги, содержащих в виде соответствующих линий реакционные и контрольную зоны.

Тест-набор № 6 хранят в холодильнике при температуре от 2°С до 8°С не более 12 мес. Перед началом работы необходимое количество тест-наборов выдерживают при температуре от 15 до 30°С в течение 10 мин. Термостат или водяную баню нагревают до температуры 47,5±1,0°С.

Техника определения

Пипеткой вносят 0,2 мл анализируемого молока в флакон. Флакон помещают в термостат или на водяную баню. В флакон, находящийся в термостате (на водяной бане), помещают индикаторную полоску хроматографической бумаги и выдерживают при температуре 47,5±1°С в течение 5 мин. Затем индикаторную полоску хроматографической бумаги извлекают из флакона и считывают результат.

Обработка результатов. Сравнивают интенсивность цвета окрашенных в красный цвет зон, появившихся на индикаторной полоске хроматографической бумаги в виде линий (рис. 8).

определение наличия антибиотиков

Рис. 8. Примеры результатов определения наличия антибиотиков с использованием тест-набора № 61 – антибиотики отсутствуют; 2 – присутствует стрептомицин; 3 – присутствует левомицетин; 4 – присутствуют левомицетин и стрептомицин; 5 – недействительный результат

Зона верхней части индикаторной полоски хроматографической бумаги является контрольной. Если после проведения определения окрашивания контрольной зоны не произошло, то определение наличия антибиотиков в молоке повторяют с новым тест-набором. Зона определения левомицетина на индикаторной полоске хроматографической бумаги расположена под контрольной зоной. Зона определения стрептомицина – под контрольной зоной второй. Большая интенсивность цвета зон определения антибиотиков по сравнению с интенсивностью цвета контрольной зоны свидетельствует об отсутствии антибиотиков в анализируемом молоке. Меньшая или равная интенсивность цвета зон определения антибиотиков по сравнению с интенсивностью цвета контрольной зоны, а также отсутствие их окрашивания указывают на наличие антибиотиков в анализируемом молоке.

3.3. Методы одновременного определения наличия антибиотиков бета-лактамного типа, тетрациклиновой группы, левомицетина и стрептомицина

Метод с использованием тест-набора № 7. Метод основан на реакции комплексообразования антибиотиков беталактамного типа, тетрациклиновой группы, левомицетина и стрептомицина со специфическими белковыми рецепторами, меченными коллоидным золотом, и последующем визуальном выявлении оставшихся свободными меченых рецепторов путем хроматографии на индикаторных полосках хроматографической бумаги, содержащих в виде соответствующих линий реакционные и контрольную зоны. Метод распространяется на молоко и сыворотку, в том числе сухую.

Техника определения

Микропробирки извлекают из пенала и помещают в термостат или на водяную баню с температурой 40±3°С. В каждую микропробирку пипеткой с наконечником вносят 0,2 мл анализируемого молока, перемешивают, наполняя и сливая содержимое с помощью пипетки пять раз для получения однородного раствора, и выдерживают в термостате (на водяной бане) в течение 5 мин. Для каждой микролунки используют новый наконечник на пипетку.

Индикаторные полоски хроматографической бумаги извлекают из пенала, помещают в микропробирки и выдерживают в термостате (на водяной бане) при температуре 40±3°С в течение 5 мин. По истечении времени индикаторные полоски хроматографической бумаги извлекают из микропробирок и считывают результат способом, рекомендуемым изготовителем тест-набора. Определение с использованием контрольных растворов проводят, как указано выше, при этом в одну микропробирку пипеткой с наконечником вносят 0,2 мл раствора «Positive Standard», в другую – 0,2 мл раствора «Negative Standard».

Обработка результатов. Сравнивают интенсивность цвета окрашенных в красный цвет зон, появившихся на индикаторных полосках хроматографической бумаги в виде линий (рис. 9).

определение наличия антибиотиков

Рис. 9. Примеры результатов определения наличия антибиотиков с использованием тест-набора № 71― антибиотики отсутствуют; 2 – присутствуют антибиотики тетрациклиновой группы; 3 – присутствует левомицетин; 4 – присутствует стрептомицин; 5 – присутствуют антибиотики беталактамного типа; 6 – недействительный результат.

Зона верхней части индикаторной полоски хроматографической бумаги является контрольной. Если после проведения определения окрашивания контрольной зоны не произошло, то определение наличия антибиотиков в молоке повторяют с новым тест-набором. Зона определения антибиотиков тетрациклиновой группы в анализируемом молоке расположена под контрольной зоной первой. Зона определения левомицетина – под контрольной зоной второй.

Зона определения стрептомицина – под контрольной зоной третьей. Зона определения антибиотиков беталактамного типа – под контрольной зоной четвертой. Большая интенсивность цвета зон определения антибиотиков по сравнению с интенсивностью цвета контрольной зоны свидетельствует об отсутствии антибиотиков в анализируемом молоке. Меньшая или равная интенсивность цвета зоны определения антибиотиков, по сравнению с интенсивностью цвета контрольной зоны, а также отсутствие окрашивания указывают на наличие антибиотиков в анализируемом молоке. При проведении определений с применением контрольных растворов «Positive Standard» и «Negative Standard» обработку результатов проводят, как указано выше.

Метод с использованием тест-набора № 8. Метод основан на реакции комплексообразования антибиотиков беталактамного типа, тетрациклиновой группы, левомицетина и стрептомицина со специфическими белковыми рецепторами, меченными коллоидным золотом, и последующем визуальном выявлении оставшихся свободными меченых рецепторов путем хроматографии на индикаторных полосках хроматографической бумаги, содержащих в виде соответствующих линий реакционные и контрольную зоны.

Техника определения

Пипеткой вносят 0,3 мл анализируемого молока во флакон. Флакон помещают в термостат или на водяную баню. Во флакон, находящийся в термостате (на водяной бане), помещают индикаторную полоску хроматографической бумаги и выдерживают при температуре 47,5±1°С в течение 10 мин. Затем индикаторную полоску хроматографической бумаги извлекают из флакона и считывают результат способом, рекомендуемым изготовителем тест-набора.

Сравнивают интенсивность цвета окрашенных в красный цвет зон, появившихся на индикаторной полоске хроматографической бумаги в виде линий (рис. 10). Зона верхней части индикаторной полоски хроматографической бумаги является контрольной. Если после проведения определения окрашивания контрольной зоны не произошло, то определение наличия антибиотиков в молоке повторяют с новым тест-набором. Зона определения антибиотиков тетрациклиновой группы в анализируемом молоке расположена под контрольной зоной первой.

определение наличия антибиотиков

Рис. 10. Примеры результатов определения наличия антибиотиков с использованием тест-набора № 81 – антибиотики отсутствуют; 2 – присутствуют антибиотики тетрациклиновой группы; 3 – присутствует левомицетин; 4 – присутствует стрептомицин; 5 – присутствуют антибиотики беталактамного типа; 6 – недействительный результат

Зона определения левомицетина – под контрольной зоной второй. Зона определения стрептомицина – под контрольной зоной третьей. Зона определения антибиотиков бета-лактамного типа – под контрольной зоной четвертой. Большая интенсивность цвета зон определения антибиотиков по сравнению с интенсивностью цвета контрольной зоны свидетельствует об отсутствии антибиотиков в анализируемом молоке. Меньшая или равная интенсивность цвета зоны определения антибиотиков, по сравнению с интенсивностью цвета контрольной зоны, а также отсутствие окрашивания указывают на наличие антибиотиков в анализируемом молоке.

Метод с использованием тест-набора № 10. Метод основан на реакции комплексообразования антибиотиков беталактамного типа, тетрациклиновой группы, стрептомицина и левомицетина со специфическими белковыми рецепторами, меченными коллоидным золотом, и последующем визуальном выявлении оставшихся свободными меченых рецепторов путем хроматографии на индикаторных полосках хроматографической бумаги, содержащих в виде соответствующих линий реакционные и контрольную зоны.

Подготовка к определению. Тест-набор № 10 хранят в холодильнике при температуре 6±2°С не более 12 мес. с даты производства. Перед началом работы необходимое количество микропробирок извлекают из тест-набора.

Техника определения

Пипетку вместимостью 0,2 мл наполняют анализируемым молоком, выливают в микропробирку, перемешивают с ее содержимым, наполняя и сливая его с помощью пипетки пять раз, до образования розового цвета, и выдерживают в течение 3 мин. Индикаторную полоску хроматографической бумаги помещают в микропробирку на 7–8 мин., затем извлекают, кладут на чистую сухую поверхность и считывают результат.

Обработка результатов. Сравнивают интенсивность цвета окрашенных в красный цвет зон, появившихся на индикаторной полоске хроматографической бумаги в виде линий (рис. 11).

определение наличия антибиотиков

Рис. 11. Примеры результатов определения наличия антибиотиков с использованием тест-набора № 10: 1 – антибиотики отсутствуют; 2 – присутствуют антибиотики бета-лактамного типа; 3 – присутствуют антибиотики тетрациклиновой группы; 4 – присутствует стрептомицин; 5 – присутствует левомицетин; 6 – недействительный результат

Зона верхней части индикаторной полоски хроматографической бумаги является контрольной. Если после проведения определения окрашивания контрольной зоны не произошло, то определение наличия антибиотиков в молоке повторяют с новым тест-набором. Зона определения антибиотиков беталактамного типа на индикаторной полоске хроматографической бумаги расположена под контрольной зоной первой. Зона определения антибиотиков тетрациклиновой группы – под контрольной зоной второй. Зона определения стрептомицина – под контрольной зоной третьей. Зона определения левомицетина – под контрольной зоной четвертой. Большая интенсивность цвета зон определения антибиотиков по сравнению с интенсивностью цвета контрольной зоны свидетельствует о том, что концентрация определяемых антибиотиков в анализируемом молоке менее предела обнаружения. Меньшая или равная интенсивность цвета зон определения антибиотиков по сравнению с интенсивностью цвета контрольной зоны, а также отсутствие их окрашивания указывают на то, что концентрация определяемых антибиотиков в анализируемом молоке больше или равна пределу обнаружения.

3.4. Определение содержания антибиотиков методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Требования ГОСТ 33526 распространяются на молоко и продукты переработки молока: (молоко (сырое, питьевое), сливки (сырые, питьевые), молочные продукты, молокосодержащие продукты, побочные продукты переработки молока, продукцию детского питания на молочной основе, сыр и сырные продукты, масло из коровьего молока и масляную пасту, консервы молочные, мороженое и смеси для мороженого и устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии по определению остаточного содержания антибиотиков: левомицетина (хлорамфеникола), пенициллиновой группы, стрептомицина, тетрациклиновой группы.

Диапазон измерений массовых долей антибиотиков для левомицетина – от 0,0001 до 1,0 млн-1 (мг/кг), для антибиотиков пенициллиновой и тетрациклиновой групп – от 0,001 до 1,0 млн-1 (мг/кг), для стрептомицина – от 0,005 до 1,0 млн-1 (мг/кг).

Метод основан на экстракции антибиотиков из пробы продукта, очистке экстракта и определении антибиотиков в экстракте методом высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим детектированием.

3.5. Инструментальный экспресс-метод определения антибиотиков

ГОСТ 32254 устанавливает инструментальный экспрессметод определения наличия антибиотиков: пенициллинов, тетрациклиновой группы, левомицетина (хлорамфеникола), стрептомицина, сульфаниламидов в сыром и термически обработанном молоке. Пределы обнаружения антибиотиков в молоке при помощи настоящего метода:

  • левомицетин (хлорамфеникол) – 0,00015 млн-1 (мг/кг);
  • тетрациклиновая группа – 0,01 млн-1 (мг/кг);
  • стрептомицин – 0,1 млн-1 (мг/кг);
  • пенициллины – 0,002 млн-1 (мг/кг);
  • сульфаниламиды – 0,1 млн-1 (мг/кг).

Инструментальный экспресс-метод определения наличия антибиотиков позволяет тестировать с достоверностью не менее 95%, т.е. вероятность того, что молоко, свободное от антибиотиков, даст положительный результат, составляет 5%.

Метод основан на связывании остаточных количеств антибиотиков, находящихся в испытуемом образце молока, с антителами, вызывающими окрашиваемую иммунохроматическую реакцию с последующим определением интенсивности окраски продуктов биохимической реакции визуальным методом или измерением инструментально при помощи считывающего устройства, позволяющего методом оптического отражения определить степень интенсивности окраски относительно включенного в тестовую полоску контрольного количества антибиотика (предела обнаружения), и выведением на дисплей идентификационных данных о типе определяемого антибиотика и о его наличии или отсутствии в течение 2–8 мин. с сохранением идентификационных данных микропроцессором прибора и на приложенной флеш-карте.

Оборудование, материалы, реактивы. Холодильник бытовой, позволяющий поддерживать температуру от 0 до 12°С; морозильная камера, позволяющая поддерживать температуру минус 20±2°С; термостат-инкубатор Rosa Incubator или прибор, совмещающий в себе функции инкубатора и считывающего устройства – EZ Reader (Charm Sciences, Inc); считывающее устройство EZ Reader или PEARL-X (Charm Sciences, Inc); специальное программное обеспечение EZ Export, поставляемое в виде диска вместе со считывающим устройством EZ Reader или PEARL-X (Charm Sciences, Inc), позволяющее сохранять данные со считывающего устройства на персональном компьютере в виде электронного лабораторного журнала; контрольный образец сухого молока, не содержащего антибиотики, поставляемый в комплекте с набором для экспресс-анализа антибиотиков (Charm Sciences, Inc); тест-наборы для определения наличия антибиотиков: набор № 1 – набор для экспресс-анализа пенициллинов/ антибиотиков тетрациклиновой группы в молоке LFMRLBLRFTET2 (Charm Sciences, Inc), включающий тестовые полоски, контрольный образец пенициллина/антибиотика тетрациклиновой группы, содержащий 0,004 млн-1 (мг/кг) пенициллина G и 0,1 млн-1 (мг/кг) окситетрациклина (или 0,01 млн-1 (мг/кг) тетрациклина) и емкость для разведения «контрольного образца»;

набор № 2 – набор для экспресс-анализа стрептомицина в молоке LF-STREP (Charm Sciences, Inc), включающий тестовые полоски, контрольный образец стрептомицина, содержащий 0,1 млн-1 (мг/кг) стрептомицина, и емкость для разведения контрольного образца;

набор № 3 – набор для экспресс-анализа левомицетина (хлорамфеникола) в молоке LF CAP (Charm Sciences, Inc), включающий тестовые полоски, контрольный образец левомицетина, содержащий 0,00015 млн-1 (мг/кг) левомицетина, и емкость для разведения контрольного образца;

набор № 4 – набор для экспресс-анализа сульфаниламидов в молоке LF SULF (Charm Sciences, Inc), включающий тестовые полоски, контрольный образец сульфаметазина, содержащий 0,1 млн-1 (мг/кг) сульфаметазина, и емкость для разведения контрольного образца;

набор № 5 – набор для экспресс-анализа пенициллинов/антибиотиков тетрациклиновой группы/ стрептомицина/левомицетина в молоке LF-QUAD, включающий: тестовые полоски, контрольный образец пенициллина/антибиотика тетрациклиновой группы, содержащий 0,004 млн-1 (мг/кг) пенициллина G и 0,1 млн-1 (мг/кг) окситетрациклина (или 0,01 млн-1 (мг/кг) тетрациклина), контрольный образец стрептомицина, содержащий 0,1 млн-1 (мг/кг) стрептомицина, контрольный образец левомицетина, содержащий 0,00015 млн-1 (мг/кг) или 0,0003 млн-1 (мг/кг) левомицетина, и емкость для разведения контрольного образца; одноразовые пипетки, поставляемые вместе с тестовыми наборами Charm Sciences, Inc.

4. Порядок подготовки, транспортирования и хранения образцов молока и тестовых полосок для проведения измерений

Испытуемые образцы молока перед проведением измерений должны быть тщательно перемешаны, пробы молока в потребительской таре перемешивают многократным переворачиванием упаковки.

Приготовление образца молока для длительного хранения. Перемешивают образец молока и замораживают аликвотные количества (по меньшей мере, 0,5 мл) в чистых ампулах.

Испытуемые образцы молока должны замораживаться в течение 6 часов после приготовления. Замораживают аликвотные количества при температуре не выше минус 15°C и хранят не более 2 мес.

Тестовые полоски хранят и транспортируют в плотно закрытом контейнере при температуре 0–7°C.

С целью соблюдения температурно-влажностных условий вскрытие и закрытие контейнера с тестовыми полосками производят в соответствии с инструкцией к набору тестовых полосок.

При высокой влажности ограничивают конденсацию путем открывания контейнера после того, как его нагреют до комнатной температуры (от 20 до 30 мин. после извлечения контейнера из холодильника).

Контроль уровня влажности в контейнере с тестовыми полосками осуществляют по цвету гранул внутри пакетов осушителя. В случае изменения цвета гранул с синего на пурпурный или розовый тестовые полоски считаются непригодными для использования. Извлеченные из контейнера тестовые полоски для проведения анализа допускается хранить при комнатной температуре до 12 ч. Неиспользованные тестовые полоски утилизируются.

Контрольный образец сухого молока, не содержащий антибиотики, растворяют в дистиллированной воде при температуре (40±2)°С, аккуратно встряхивают до полного растворения, не допуская пенообразования, и охлаждают до температуры 4±2°С. Необходимый объем дистиллированной воды для растворения (5 или 100 мл) указывается в сопроводительной документации к контрольному образцу.

При необходимости разведение исследуемого образца молока проводят образцом молока, не содержащим антибиотиков, приготовленным или ранее испытанным образцом сырого молока, в котором не обнаружено антибиотика(ов) и хранившимся при температуре 4±2°С не более 72 ч. либо при температуре минус 17±2°С не более 2 мес. Разведение исследуемого образца молока осуществляют в соотношениях, обеспечивающих определение содержания антибиотика в соответствии с допустимым уровнем, установленным нормативными правовыми актами.

5. Примеры разведений испытуемых образцов молока

Разведение испытуемого образца молока осуществляется образцом молока, в котором заведомо отсутствуют антибиотики, исключительно с целью обеспечения соответствия законодательно установленного в стране, принявшей настоящий стандарт, допускаемого уровня содержания данного вида антибиотика с чувствительностью используемого экспресс-теста.

Если нормативными правовыми актами, действующими на территории страны, принявшей настоящий стандарт, установлен

предел допускаемого уровня содержания стрептомицина 0,2 млн-1 (мг/кг), а чувствительность экспресс-теста (предел обнаружения стрептомицина в молоке) составляет 0,1 млн-1 (мг/кг), то испытуемый образец молока допускается развести в два раза, т.е. в соотношении 1:1, образцом молока, в котором заведомо отсутствуют антибиотики.

Если нормативными правовыми актами, действующими на территории страны, принявшей настоящий стандарт, установлен предел допускаемого уровня содержания левомицетина 0,0003 млн-1 (мг/кг), а чувствительность экспресс-теста (предел обнаружения левомицетина в молоке) составляет 0,00015 млн-1 (мг/кг), то испытуемый образец молока допускается развести в два раза, т.е. в соотношении 1 : 1, образцом молока, в котором заведомо отсутствуют антибиотики.

Техника определения

Подготовку оборудования к проведению измерений и сами измерения проводят в соответствии с Инструкцией по эксплуатации к набору тестовых полосок, инкубатору и считывающему устройству.

Инкубатор должен быть установлен на горизонтальной поверхности. Температура инкубатора устанавливается в зависимости от используемого набора для экспресс-анализа:

  • 56,0±2,0°С – для проведения измерений с использованием наборов для экспресс-анализа № 1, № 2 и № 4;
  • 40,0±2,0°С – для проведения измерений с использованием набора для экспресс-анализа № 3, № 5.

Температура инкубатора регулируется встроенным в инкубатор контрольноизмерительным прибором.

Крышка инкубатора должна быть всегда закрытой (кроме момента внесения проб молока пипеткой в тестовую полоску). Индикатор температуры в инкубаторе должен показывать 56°С, что соответствует 56,0±2,0°С, или 40°С, что соответствует 40,0±2,0°С. На пробирку с испытуемым образцом молока и на тестовую полоску, используемую для определения антибиотика(ов) в этом образце, при помощи маркера наносят одинаковую метку, позволяющую идентифицировать испытуемые образцы.

Открыв крышку инкубатора, помещают тестовую полоску в специальную секцию плоской поверхностью тестовой полоски вверх, а выпуклой – вниз для плотного прилегания полоски в инкубаторе. Придерживая полоску в инкубаторе, отклеивают защитное покрытие с тестовой полоски. Перемешивают образец молока и набирают пробу одноразовой пипеткой, избегая образования пены. Осторожно вносят 0,3 мл пробы пипеткой, держа ее вертикально, в специальную ячейку тестовой полоски.

Запечатывают полоску в отсеке путем прижимания и закрывают крышку инкубатора. При проведении теста с несколькими образцами в одном инкубаторе выполняют процедуру снятия покрытия, внесения молока и запечатывания для каждой полоски отдельно. Продолжительность инкубации, в зависимости от используемого набора для экспрессанализа, составляет:

  • для набора № 1 – 2 мин.;
  • для наборов № 2, № 3 и № 4 – 8 мин.

По окончании инкубации извлекают тестовую полоску из инкубатора и приступают к визуальной обработке результатов измерений.

Обработку результатов измерений сначала производят визуально, а затем для подтверждения результата – инструментально, т.е. с использованием считывающего устройства или оборудования, совмещающего в себе функции инкубатора и считывающего устройства.

В случае использования оборудования, совмещающего в себе функции инкубатора и считывающего устройства, дополнительного подтверждения результата при помощи считывающего устройства не требуется. Результаты анализа выводятся на информационное табло прибора, отображаются на дисплее и сохраняются в памяти прибора или на приложенной флеш-карте.

Визуальное наблюдение проводят с целью установления результата анализа как недействительный или действительный.

В случае если контрольная линия С (рис. 12) отсутствует, размыта, неровная или неравномерно окрашена или если проба молока затемняет контрольную линию (линию С) или линию с антибиотиками [линии BL (пенициллины) и ТЕ (тетрациклины) на рис. 12], результат анализа считается недействительным, и требуется повторное проведение анализа данного образца молока.

Недействительный результат визуального анализа

Рис. 12. Недействительный результат визуального анализа

Анализ является недействительным, если:

  • линия C отсутствует;
  • линия C размытая или неровная;
  • проба заслоняет линии.

Дальнейший анализ недействительных результатов (при помощи считывающего устройства) не проводится.

В случае если все линии на тестовой полоске [линия С контрольная, линии с антибиотиками – BL (пенициллины) и Т или ТЕ (тетрациклины)] присутствуют и четко просматриваются, и при этом окраска контрольной линии светлее линии(ий) с антибиотиками, то результат визуального анализа считается действительным и указывает на отсутствие антибиотика(ов) в испытуемой пробе (рис. 13).

Действительный результат визуального анализа

Рис. 13. Действительный результат визуального анализа, показывающий отсутствие антибиотика(ов) в испытуемой пробе

В случае, если все линии на тестовой полоске [линия С (контрольная), линии с антибиотиками – BL (пенициллины) и Т или ТЕ (тетрациклины)] присутствуют и четко просматриваются, и при этом окраска контрольной линии темнее линии(ий) с антибиотиками, то результат визуального анализа считается действительным и указывает на присутствие антибиотика(ов) в испытуемой пробе (рис. 14).

Результаты визуального анализа, показывающие присутствие антибиотика в пробе

Рис. 14. Результаты визуального анализа, показывающие присутствие антибиотика(ов) в пробе

По усмотрению оператора при помощи считывающего устройства проводится инструментальная обработка результатов визуального анализа (тестовой полоски с действительным результатом визуального анализа по рис. 6 или 7 приложение 15). В случае использования прибора, совмещающего в себе функции инкубатора и считывающего устройства, инструментальная обработка результатов визуального анализа не требуется.

В течение 5 мин. после получения действительных результатов визуального анализа вводят испытуемую тестовую полоску в считывающее устройство и проводят инструментальное подтверждение визуально полученного результата путем считывания тестовой полоски в соответствии с инструкцией к считывающему устройству.

Результат анализа, подтвержденный инструментальным путем, а также данные о типе определяемого антибиотика(ов), его(их) наличии или отсутствии, дате проведения измерений, номере испытуемой пробы, других идентификационных показателях пробы в зависимости от заданных оператором параметров измерений, выводимых на информационное табло считывающего устройства, отображаются на дисплее и сохраняются в памяти считывающего устройства или на приложенной флеш-карте.

Данные результатов инструментального анализа при помощи считывающего устройства по усмотрению могут быть экспортированы на присоединенный персональный компьютер через порт USB и сохраняться там при помощи специального программного обеспечения, поставляемого со считывающим устройством. Результат анализа, а именно факт отсутствия или присутствия антибиотика(ов) в пробе (отрицательный результат или положительный результат) отображается в информационных данных на дисплее считывающего устройства.

Факт отсутствия антибиотика в пробе отображается в информационных данных на дисплее считывающего устройства в виде сочетания цифр со знаком «–» и слов «Результат отрицательный».

Факт присутствия антибиотика в пробе отображается в информационных данных на дисплее считывающего устройства в виде сочетания цифр или цифр со знаком «+», латинских букв, обозначающих группу обнаруженных антибиотиков, и слов «Результат положительный».

Результат анализа выводится на информационное табло считывающего устройства, отображается на дисплее и сохраняется в памяти считывающего устройства или на приложенной флешкарте в виде данных о типе определяемого антибиотика(ов), его(их) наличии или отсутствии, дате проведения измерений, номере испытуемой пробы.

Данные результатов инструментального анализа при помощи считывающего устройства по усмотрению оператора могут быть экспортированы на присоединенный персональный компьютер через порт USB и сохраняться там при помощи специального программного обеспечения, поставляемого со считывающим устройством.

Факт отсутствия антибиотика в пробе отображается в информационных данных на дисплее считывающего устройства в виде сочетания цифр со знаком «–» и слов «Результат отрицательный».

Факт присутствия антибиотика в пробе отображается в информационных данных на дисплее считывающего устройства в виде сочетания цифр или цифр со знаком «+», латинских букв, обозначающих группу обнаруженных антибиотиков, и слов «Результат положительный».

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *